이 프로토콜은 마우스 모델에서 열 사멸 마이코박테리아를 사용하여 신뢰할 수 있고 강력한 안구 염증을 유도하는 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프라이밍 된 마이코 박테리아 포도막염 모델은 마이코 박테리아 감염 후 발생하는 만성 면역 매개 안구 염증의 메커니즘을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 만성 포도막염의이 모델은 특정 마우스 균주의 사용 또는 안구 항원 면역을 필요로하지 않습니다.
이 모델은 안구 염증의 발병 기전에 대한 기계 론적 연구에서 트랜스 제닉 및 유전자 녹아웃 마우스 라인의 사용을 용이하게합니다. 이 PMU 모델은 인간의 안구 염증 또는 포도막염에 대한 새로운 치료법을 테스트하는 연구에 도움이 될 것입니다. 새로운 안약 또는 전신 투여 면역 조절제와 같은 치료법은이 모델로 효능을 테스트 할 수 있습니다.
이 모델은 열 사멸 마이코 박테리아 항원이 눈과 같은 면역 특권 기관의 미세 환경을 어떻게 변화시키는 지 연구하는 것을 용이하게 할 것입니다. 이러한 결과는 또한 다른 유형의 안구 감염이 눈에 어떤 영향을 미치는지 또는 뇌와 같은 면역 특권 부위가 미생물 항원에 어떻게 반응하는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 시작하려면 초음파 처리기 변환기 장치의 본체를 풀고 70 % 알코올 면봉으로 프로브를 청소하십시오.
그런 다음 초음파 처리기를 켜고 전원 제어 노브를 돌려 전원 설정을 4로 조정합니다. 다음으로, PBS에서 결핵균 H37Ra의 미세 현탁액을 생성하려면 프로브의 팁을 PBS 함유 미생물 분말에 담그십시오. 혼합물을 얼음에 30 초 동안 초음파 처리 한 다음 30 초 동안 일시 중지하고 총 5 분 동안 반복하여 액체를 가열하지 않고 분말을 균일 한 현탁액으로 완전히 분산시킵니다.
다음으로, 혼합물에 2.5 밀리리터의 Freund의 불완전 보조제를 첨가하고, 에멀젼이 치약과 같은 일관성을 형성 할 때까지 얼음에서 초음파 처리 과정을 반복하십시오. 피하 주사의 경우, 200 내지 300 마이크로리터의 마이크로박테리아 에멀젼을 1 밀리리터 주사기에 로딩한다. 주사기에서 공기를 배출하고 채워질 때까지 간헐적 인 반전 및 두드리기로 주사기를 계속 채 웁니다.
다음으로, 마취된 6-10주령 C57 검정 6J 마우스의 사타구니 림프절 영역에 근접한 다리의 복부 표면 또는 엉덩이의 등쪽 표면 또는 다리의 복부 표면에 피하 주사를 놓습니다. 근육에 침투하지 않도록주의하면서 바늘을 조심스럽게 삽입하고 50 마이크로 리터의 에멀젼을 피하 공간에 주입하십시오. 두꺼운 에멀젼이 완전히 주입 될 수 있도록 바늘을 즉시 제거하지 마십시오.
유리체 내 주사를 위한 항원 스톡을 준비하려면 이전에 시연된 대로 PBS 용액에서 H37Ra를 초음파 처리한 다음 용액을 100마이크로리터 부피로 분취하고 섭씨 20도에서 보관합니다. 주사 당일에 전신 마취의 깊이를 확인한 후 0.5 % 테트라 카인 한 방울로 각막을 마취시키고 2.5 % 페닐에 프린 한 방울로 동공을 확장시킵니다. 과도한 액체를 제거한 후 눈 표면과 주변 모발에 5% 베타딘 한 방울을 추가하여 안구내염의 위험을 줄입니다.
2-3 분 후 Betadine을 제거하고 0.3 % 하이 프로 멜로 오스 젤로 눈을 덮어 마취 및 백내장 형성시 건조를 방지합니다. 그런 다음 항원과 플루오레세인 혼합물이 포함된 10마이크로리터 주사기를 로드한 다음 마우스를 플랫폼의 엎드린 위치에 놓고 오른쪽 및 왼쪽 이어바를 사용하여 마우스 헤드를 고정합니다. 오른쪽 눈의 상비강이 보이도록 마우스를 스코프 아래에 배치하고 방향을 지정합니다.
그런 다음 30게이지 바늘을 사용하여 속눈썹을 옮기고 공막을 노출하고 윤부와 요골 혈관을 시각화합니다. 다음으로, 멸균 된 30 게이지 바늘을 사용하여 윤부 뒤쪽 1-2 밀리미터의 공막에 가이드 구멍을 만듭니다. 그런 다음 주입 홀더에 부착 된 34 게이지 바늘을 가이드 구멍을 통해 렌즈를 피할 수있는 각도로 눈에 삽입하되 바늘 끝을 유리체에 넣습니다.
마이크로 주사기 펌프 컨트롤러를 사용하여 M.tuberculosis 추출물 1 마이크로 리터를 유리체에 조심스럽게 주입합니다. 지속적인 역류의 경우 적절한 용량 전달을 보장하기 위해 주입량을 1.5 마이크로 리터로 늘리십시오. 눈의 녹색 반사를 시각화하여 유리체 내 배치를 확인하고 10 초 후에 눈에서 바늘을 제거하십시오.
마우스를 마취 한 후 2.5 % 페닐에 프린 한 방울로 동공을 확장시켜 과도한 물방울이 코 나 입에 들어 가지 않도록하십시오. 2-3 분 후, 여분의 액체를 두드리고 0.3 % 하이 프로 멜로 오스 젤로 눈을 덮으십시오. 그런 다음 마우스를 수술 용 거즈 층으로 감싸서 몸의 따뜻함을 유지 한 다음 마우스를 동물 카세트에 놓고 바이트 바가있는 머리를 놓습니다.
광학 간섭 단층 촬영 또는 OCT 이미지를 얻으려면 OCT 이미징 시스템을 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다. 후방 챔버 이미징의 경우 OCT를 눈 표면에 가깝게 가져오고 렌즈 표면이 눈에 닿지 않도록 주의하십시오. 눈의 위치가 올바르게 지정되면 빠른 스캔을 중지하고 볼륨 스캔 프로토콜을 선택한 다음 조준 옵션으로 스캔을 활성화합니다.
후방 세그먼트 이미지의 경우 시신경이 수평 B 스캔 정렬 이미지의 중앙에 있고 망막이 수직 정렬 축과 정렬될 때까지 조정합니다. 전방 세그먼트 이미지의 경우 수평 B-스캔 정렬 이미지와 수직 B-스캔 정렬 이미지 모두에서 각막의 정점을 중앙에 배치하도록 위치를 조정합니다. 마지막으로 Snapshot을 클릭하여 볼륨 스캔 이미지를 캡처한 다음 저장을 클릭합니다.
유리체내 주사 24시간 후, 염증 세포는 수성 및 유리체에서 보인다. 각막 부종, hypopyon 및 여러 개의 자유 부유 염증 세포가 전방에서 보이고 후방에서 유리체염이 보입니다. 안구 염증의 정도는 이러한 OCT 이미지에서 점수를 매길 수 있습니다.
0보다 크지만 2.5보다 작은 점수를 합친 것은 경미한 염증을 나타냅니다. 점수는 2.5보다 크지만 4.5보다 작습니다. 는 중등도의 염증을 나타내며 4.5보다 큰 점수는 심각한 염증을 나타냅니다.
염증 점수는 또한 헤마톡실린 및 에오신 염색 섹션에서 볼 수 있는 5가지 특성을 사용하여 결정할 수 있습니다. 중증도 점수는 수성 및 유리체에서 염증 세포의 수를 세는 것에 의해 결정된다. 명시야 종단 안저 영상은 또한 망막 및 혈관 주위 염증을 식별할 수 있습니다.
심하게 염증이 있는 눈은 망막에 여러 개의 흰색 침윤과 컬러 안저 영상에서 혈관 비틀림을 나타내며, 둘째 날에는 10월째에 치밀한 유리염과 망막 부종이 나타납니다. 경미하게 염증이있는 눈은 안저에서 점점 더 신중한 선형 병변을 보이고 유리체 공간에 많은 침투 세포를 나타냅니다. 피하 및 유리체 내 주사 중 일관성을 보장하고 감염성 안구 내염의 발병을 예방하기위한 적절한 조치를 취하는 것이이 모델을 성공적으로 복제하는 데 도움이되는 핵심 단계입니다.
생체 내 생물 발광 이미징을 사용하여 염증을 특성화할 수 있으며, 다중 파라미터와 같은 사후 분석을 수행하여 침윤 면역 세포 유형 집단을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 사이토카인 분석, mRNA 시퀀싱 및 면역형광 이미징을 사용하여 포도막염에서 유전자 및 단백질 발현 패턴을 평가하거나 망막 면역 세포 집단을 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 미래의 연구자가 마우스의 유리체 내 공간에 접근하는 데 도움이 될 재현 가능한 무균 및 최소 외상 주사를 수행하는 방법을 보여줍니다.
OCT는 또한 작은 실험 동물의 눈을 육안으로 검사하여 놓칠 수 있는 안구 염증을 감지하는 데 중요한 역할을 합니다.
