このプロトコルは、マウスモデルで熱死したマイコバクテリアを使用して、信頼性が高く堅牢な眼の炎症を誘発する手順の概要を示しています。このプライミングされたマイコバクテリアブドウ膜炎モデルは、マイコバクテリア感染後に発症する慢性免疫媒介性眼炎のメカニズムを研究するのに役立ちます。慢性ブドウ膜炎のこのモデルは、特定のマウス系統の使用または眼抗原による免疫を必要としない。
このモデルは、眼の炎症の病因の機構研究におけるトランスジェニックおよび遺伝子ノックアウトマウス株の使用を容易にします。このPMUモデルは、ヒトの眼の炎症またはブドウ膜炎の新しい治療法をテストする研究に役立ちます。新しい点眼薬や全身投与された免疫調節剤などの治療法は、このモデルで有効性をテストできます。
このモデルは、熱死したマイコバクテリア抗原が目のような免疫特権器官の微小環境をどのように変化させるかの研究を容易にします。これらの結果は、他の種類の眼感染症が眼にどのように影響するか、または脳などの免疫特権部位が微小細菌抗原にどのように反応するかについての洞察も提供する可能性があります。まず、クランプを解除します ソニケーターコンバーターユニットの本体 70%アルコール綿棒でプローブを清掃します。
次に、超音波処理器の電源を入れ、電源制御ノブを回して電源設定を4に調整します。次に、PBS中に結核菌H37Raの微細懸濁液を生成し、プローブの先端をPBS含有微小細菌粉末に浸漬する。氷上で混合物を30秒間超音波処理し、次いで30秒間休止し、液体を加熱せずに粉末を均一な懸濁液に完全に分散させるために合計5分間繰り返す。
次に、2.5ミリリットルのフロイント不完全アジュバントを混合物に加え、エマルジョンが練り歯磨きのような粘稠度を形成するまで氷上で超音波処理プロセスを繰り返します。皮下注射の場合は、1ミリリットルの注射器に200〜300マイクロリットルのマイクロバクテリアエマルジョンをロードします。シリンジから空気を排出し、充填されるまで断続的な反転とタッピングでシリンジを充填し続けます。
次に、6〜10週齢の麻酔をかけたC57黒6Jマウスの鼠径リンパ節の領域に近い腰の背側表面または脚の腹側表面のいずれかに皮下注射を行います。筋肉を貫通しないように注意しながら針を慎重に挿入し、50マイクロリットルのエマルジョンを皮下腔に注入します。濃厚なエマルジョンを完全に注入するために、すぐに針を取り外さないでください。
硝子体内注射用の抗原ストックを調製するには、前述のようにPBS溶液中のH37Raを超音波処理し、次いで溶液を100マイクロリットルの容量に分注し、摂氏20度で保存する。注射当日、全身麻酔の深さを確認した後、0.5%テトラカイン1滴で角膜を麻酔し、2.5%フェニレフリン1滴で瞳孔を拡張します。余分な液体を軽くたたいた後、眼内炎のリスクを減らすために、目の表面と周囲の髪に5%ベタジンを1滴加えます。
2〜3分後、ベタジンを取り除き、麻酔下での乾燥と白内障の形成を防ぐために、0.3%ヒプロメロースゲルで目を覆います。次に、抗原とフルオレセインの混合物を入れた10マイクロリットルの注射器をロードし、マウスをプラットフォーム上の腹臥位に置き、左右のイヤーバーを使用してマウスの頭を固定します。マウスをスコープの下に配置して向きを変え、右目の上鼻面が見えるようにします。
次に、30ゲージの針を使用して、まつげを変位させ、強膜を露出させ、辺縁と橈骨血管を視覚化します。次に、滅菌済みの30ゲージ針を使用して、辺縁の後方1〜2ミリメートルの強膜にガイド穴を開けます。次に、注射ホルダーに取り付けられた34ゲージの針を、ガイドホールを通して、レンズを避ける角度で目に挿入しますが、針の先端を硝子体腔に入れます。
マイクロシリンジポンプコントローラーを使用して、1マイクロリットルの結核菌抽出物を硝子体腔に慎重に注入します。一貫した逆流の場合は、適切な用量送達を確保するために注射量を1.5マイクロリットルに増やします。.目の緑がかった反射を視覚化して硝子体内配置を確認し、10秒後に針を目から外します。
マウスを麻酔した後、2.5%フェニレフリンを1滴で瞳孔を拡張し、余分な液滴が鼻や口に入るのを防ぎます。2〜3分後、余分な液体を軽くたたき、0.3%ヒプロメロースゲルで目を覆います。次に、体の暖かさを維持するためにマウスを外科用ガーゼの層で包み、次にマウスを動物カセットの上に置き、バイトバーで頭を配置します。
光干渉断層撮影またはOCT画像を取得するには、OCTイメージングシステムの電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。後房イメージングの場合は、水晶体の表面が眼に接触しないように注意しながら、OCTを眼の表面に近づけてください。目が正しく配置されたら、高速スキャンを停止し、ボリュームスキャンプロトコルを選択して、[照準]オプションでスキャンをアクティブにします。
後部セグメント画像の場合、視神経が水平Bスキャンアライメント画像の中心に揃い、網膜が垂直アライメント軸に揃うように調整します。前眼部画像の場合は、水平B-スキャンアライメント画像と垂直B-スキャンアライメント画像の両方で角膜の頂点を中央に配置するように位置を調整します。最後に、[スナップショット]をクリックしてボリュームスキャンイメージをキャプチャし、[保存]をクリックします。
硝子体内注射の24時間後、水性および硝子体に炎症細胞が見られます。前房には角膜浮腫、低血圧、および複数の浮遊炎症細胞が見られ、後房には硝子体炎が見られます。眼の炎症の程度は、これらのOCT画像でスコアリングできます。
ゼロより大きく2.5未満の合計スコアは、軽度の炎症を表します。スコアが 2.5 より大きく、4.5 未満。中等度の炎症を表し、4.5を超えるスコアは重度の炎症を識別します。
炎症スコアは、ヘマトキシリンおよびエオジン染色切片に見られる5つの特性を使用して決定することもできます。重症度スコアは、水性および硝子体中の炎症細胞の数をカウントすることによって決定される。明視野縦眼底イメージングは、網膜および血管周囲の炎症を特定することもできます。
重度の炎症を起こした眼は、カラー眼底イメージングで網膜に複数の白い浸潤と血管の曲がりを示し、2日目のOCTで高密度硝子体炎と網膜浮腫を示します。軽度の炎症を起こした眼は、眼底の目立たない線状病変がますます少なくなり、硝子体腔に多数の浸潤細胞が見られます。皮下注射および硝子体内注射中の一貫性を確保し、感染性眼内炎の発症を防ぐための適切な対策を講じることは、このモデルを正常に複製するのに役立つ重要なステップです。
in vivo生物発光イメージングは炎症の特性評価に使用でき、マルチパラメーターフローサイトメトリー分析などの死後アッセイを実行して、浸潤免疫細胞タイプの集団を識別および定量化できます。サイトカイン分析、mRNAシーケンシング、および免疫蛍光イメージングを使用して、ブドウ膜炎の遺伝子およびタンパク質発現パターンを評価したり、網膜免疫細胞集団を特定したりできます。このプロトコルは、将来の研究者がマウスの硝子体内空間にアクセスするのに役立つ、再現性のある、無菌性、および最小限の外傷性注射を実行する方法を示しています。
OCTは、小実験動物の目の目視検査では見逃されがちな眼の炎症を検出する上でも重要な役割を果たします。
