该协议概述了在小鼠模型中使用热杀死分枝杆菌诱导可靠和强大的眼部炎症的步骤。这种引发的分枝杆菌葡萄膜炎模型可以帮助研究分枝杆菌感染后发生的慢性免疫介导的眼部炎症的机制。这种慢性葡萄膜炎模型不需要使用特定的小鼠品系或用眼部抗原免疫。
该模型有助于在眼部炎症发病机制研究中使用转基因和基因敲除小鼠系。该PMU模型将有助于测试人类眼部炎症或葡萄膜炎的新疗法的研究。可以使用该模型测试诸如新眼药水或全身给药的免疫调节剂之类的治疗方法的功效。
该模型将有助于研究热杀死的分枝杆菌抗原如何改变眼睛等免疫特权器官的微环境。这些结果还可以提供有关其他类型的眼部感染如何影响眼睛或免疫特权位点（如大脑）如何对微细菌抗原做出反应的见解。首先，松开超声转换器单元的主体，并用 70% 酒精棉签清洁探头。
然后打开音速器并通过转动功率控制旋钮将功率设置调整为 4。接下来，要在PBS中产生结核微杆菌H37Ra的细悬浮液，将探针的尖端浸入含有PBS的微细菌粉末中。将混合物在冰上超声处理 30 秒，然后暂停 30 秒并重复总共 5 分钟，以将粉末完全分散到均匀的悬浮液中，而无需加热液体。
接下来，向混合物中加入2.5毫升弗氏不完全佐剂，并在冰上重复超声处理过程，直到乳液形成牙膏状稠度。对于皮下注射，在一毫升注射器中装入200至300微升微细菌乳液。从注射器中排出空气，并继续用间歇性倒置和敲击填充注射器，直到充满。
接下来，将皮下注射放在6至10周龄麻醉C57黑色6J小鼠的臀部背表面或腿部腹侧近端的腹侧。小心地插入针头，注意不要穿透肌肉，并将50微升乳液注射到皮下空间。不要立即取出针头，以使浓稠的乳液完全注入。
为了制备用于玻璃体内注射的抗原原液，如前所述，在PBS溶液中超声处理H37Ra，然后将溶液分装成100微升体积并储存在20摄氏度。注射当天，确认全身麻醉深度后，用一滴0.5%丁卡因麻醉角膜，用一滴2.5%去氧肾上腺素扩张瞳孔。擦去多余的液体后，在眼睛表面和周围头发上加入一滴 5%Betadine，以降低患眼内炎的风险。
两到三分钟后，取出Betadine并用0.3%羟丙甲纤维素凝胶覆盖眼睛，以防止麻醉下干燥和白内障形成。接下来，用抗原和荧光素混合物装入10微升注射器，然后将鼠标置于平台上的俯卧位置，并使用左右耳杆固定鼠标头部。将鼠标定位和定向到瞄准镜下方，以便可以看到右眼的鼻上侧。
然后，使用30号针移位睫毛，露出巩膜，并观察角膜缘和桡骨血管。接下来，使用无菌的 30 号针头，在巩膜后方一到两毫米处开一个导向孔。然后，将连接到注射支架的 34 号针头通过导向孔插入眼睛，角度将避开晶状体，但将针尖放入玻璃体腔中。
使用微型注射泵控制器，小心地将一微升结核分枝杆菌提取物注射到玻璃体腔中。在持续反流的情况下，将注射量增加到1.5微升，以确保足够的剂量输送。通过观察眼睛中的绿色反射来确认玻璃体内放置，并在10秒后从眼睛上取下针头。
麻醉小鼠后，用一滴2.5%去氧肾上腺素扩张瞳孔，避免多余的液滴进入鼻子或嘴巴。两到三分钟后，擦去多余的液体，用0.3%羟丙甲纤维素凝胶覆盖眼睛。接下来，将鼠标包裹在一层手术纱布中以保持身体温暖，然后将鼠标放在动物盒上，并将头部与咬杆定位。
要获取光学相干断层扫描或OCT图像，请打开OCT成像系统并打开成像软件。对于后房成像，将OCT靠近眼睛表面，注意不要使晶状体表面与眼睛接触。眼睛正确定位后，停止快速扫描，选择体积扫描协议，然后使用瞄准选项激活扫描。
对于后节图像，调整直到视神经在水平 B 扫描对齐图像中居中，并且视网膜与垂直对齐轴对齐。对于前节图像，调整位置以在水平 B 扫描对齐图像和垂直 B 扫描对齐图像中角膜的顶点居中。最后，单击快照以捕获卷扫描图像，然后单击保存。
玻璃体内注射后24小时，在房水和玻璃体中可见炎症细胞。前房可见角膜水肿、下痉和多个自由漂浮的炎症细胞，后房可见玻璃体炎。可以在这些OCT图像上对眼部炎症的程度进行评分。
综合评分大于零但小于 2.5 表示轻度炎症。分数大于 2.5，但小于 4.5。代表中度炎症，评分大于 4.5 表示重度炎症。
炎症评分也可以使用苏木精和伊红染色切片中可见的五个特征来确定。严重程度评分通过计数房水和玻璃体中的炎症细胞数量来确定。明场纵眼底成像也可以识别视网膜和血管周围炎症。
严重发炎的眼睛在彩色眼底成像上显示视网膜中有多处白色浸润和血管曲折，以及第二天OCT的致密玻璃体炎和视网膜水肿。轻度发炎的眼睛显示眼底线性病变越来越少，更隐蔽，玻璃体腔中有许多浸润细胞。确保皮下和玻璃体内注射的一致性并采取适当措施预防感染性眼内炎的发展是有助于成功复制该模型的关键步骤。
体内生物发光成像可用于表征炎症，而尸检分析（如多参数流式细胞术分析）可用于鉴定和量化浸润免疫细胞类型群体。细胞因子分析、mRNA 测序和免疫荧光成像可用于评估葡萄膜炎中的基因和蛋白质表达模式或鉴定视网膜免疫细胞群。该协议展示了如何进行可重复，无菌和最小创伤的注射，这将有助于未来的研究人员进入小鼠的玻璃体内空间。
OCT还将在检测眼部炎症方面发挥重要作用，否则小型实验动物的眼睛目视检查可能会错过这些炎症。
