Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Induktion einer zuverlässigen und robusten Augenentzündung unter Verwendung von hitzeabgetöteten Mykobakterien im Mausmodell. Dieses präparierte mykobakterielle Uveitis-Modell kann helfen, die Mechanismen der chronischen immunvermittelten Augenentzündung zu untersuchen, die sich nach einer mykobakteriellen Infektion entwickelt. Dieses Modell der chronischen Uveitis erfordert keine Verwendung spezifischer Mausstämme oder Immunisierung mit okulären Antigenen.
Dieses Modell ermöglicht die Verwendung von transgenen und Gen-Knockout-Mauslinien in mechanistischen Studien der Pathogenese von Augenentzündungen. Dieses PMU-Modell wird in Studien hilfreich sein, in denen neue Therapien für Augenentzündungen oder Uveitis beim Menschen getestet werden. Behandlungen wie neue Augentropfen oder systemisch verabreichte immunmodulierende Wirkstoffe könnten mit diesem Modell auf ihre Wirksamkeit getestet werden.
Dieses Modell wird es erleichtern zu untersuchen, wie hitzeabgetötete mykobakterielle Antigene die Mikroumgebung eines immunprivilegierten Organs wie des Auges verändern. Diese Ergebnisse könnten auch Erkenntnisse darüber liefern, wie sich andere Arten von Augeninfektionen auf das Auge auswirken oder wie immunprivilegierte Stellen wie das Gehirn auf mikrobakterielle Antigene reagieren. Um zu beginnen, klemmen Sie den Körper der Sonicator-Konvertereinheit ab und reinigen Sie die Sonde mit einem 70%igen Alkoholtupfer.
Schalten Sie dann den Sonicator ein und stellen Sie die Leistungseinstellung auf vier ein, indem Sie den Einschaltknopf drehen. Um eine feine Suspension des Mikrobakteriums tuberculosis H37Ra in PBS zu erzeugen, tauchen Sie die Spitze der Sonde in das PBS-haltige mikrobakterielle Pulver. Beschallen Sie die Mischung 30 Sekunden lang auf Eis, pausieren Sie dann für 30 Sekunden und wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt fünf Minuten, um das Pulver vollständig in eine gleichmäßige Suspension zu dispergieren, ohne die Flüssigkeit zu erhitzen.
Als nächstes fügen Sie der Mischung 2,5 Milliliter Freund's Incomplete Adjuvans hinzu und wiederholen Sie den Ultraschallvorgang auf Eis, bis die Emulsion eine zahnpastaähnliche Konsistenz bildet. Für die subkutane Injektion laden Sie 200 bis 300 Mikroliter der mikrobakteriellen Emulsion in eine Ein-Milliliter-Spritze. Stoßen Sie die Luft aus der Spritze aus und füllen Sie die Spritze mit intermittierendem Invertieren und Klopfen, bis sie gefüllt ist.
Als nächstes platzieren Sie die subkutanen Injektionen entweder auf der dorsalen Oberfläche der Hüften oder auf der ventralen Oberfläche der Beine proximal im Bereich der Leistenlymphknoten einer 6 bis 10 Wochen alten anästhesierten C57 schwarzen 6J-Maus. Führen Sie die Nadel vorsichtig ein, achten Sie darauf, nicht in den Muskel einzudringen, und injizieren Sie 50 Mikroliter der Emulsion in den Unterhautraum. Entfernen Sie die Nadel nicht sofort, damit die dicke Emulsion vollständig injiziert werden kann.
Um den Antigenbestand für die intravitreale Injektion vorzubereiten, wird das H37Ra wie zuvor demonstriert in PBS-Lösung beschallt, dann in 100-Mikroliter-Volumen aliquotiert und bei 20 Grad Celsius gelagert. Am Tag der Injektion, nach Bestätigung der Tiefe der Vollnarkose, betäuben Sie die Hornhaut mit einem Tropfen 0,5% Tetracain und erweitern Sie die Pupille mit einem Tropfen 2,5% Phenylephrin. Nachdem Sie überschüssige Flüssigkeit abgetupft haben, fügen Sie einen Tropfen 5% Betadin auf die Augenoberfläche und das umgebende Haar hinzu, um das Risiko einer Endophthalmitis zu verringern.
Nach zwei bis drei Minuten das Betadine entfernen und das Auge mit 0,3% Hypromellose-Gel bedecken, um Trockenheit unter Narkose und Kataraktbildung zu verhindern. Als nächstes laden Sie eine 10-Mikroliter-Spritze mit der Antigen- und Fluoreszenzmischung, platzieren Sie die Maus dann in Bauchlage auf der Plattform und verwenden Sie die rechten und linken Ohrbügel, um den Mauskopf zu fixieren. Positionieren und orientieren Sie die Maus unter dem Zielfernrohr, so dass der obere nasale Aspekt des rechten Auges sichtbar ist.
Verschieben Sie dann mit einer 30-Gauge-Nadel die Wimpern, legen Sie die Sklera frei und visualisieren Sie den Limbus und das radiale Blutgefäß. Als nächstes machen Sie mit einer sterilen 30-Gauge-Nadel ein Führungsloch in der Sklera ein bis zwei Millimeter hinter dem Limbus. Führen Sie dann die 34-Gauge-Nadel, die am Injektionshalter befestigt ist, durch das Führungsloch in einem Winkel in das Auge, der die Linse vermeidet, aber legen Sie die Nadelspitze in die Glaskörperhöhle.
Injizieren Sie mit einer Mikrospritzenpumpensteuerung vorsichtig einen Mikroliter des M.tuberculosis-Extrakts in die Glaskörperhöhle. Bei gleichmäßigem Reflux erhöhen Sie das Injektionsvolumen auf 1,5 Mikroliter, um eine ausreichende Dosisabgabe zu gewährleisten. Bestätigen Sie die intravitreale Platzierung, indem Sie einen grünlichen Reflex im Auge visualisieren, und entfernen Sie nach 10 Sekunden die Nadel aus dem Auge.
Nach der Betäubung der Maus erweitern Sie die Pupille mit einem Tropfen 2,5% Phenylephrin, um zu vermeiden, dass überschüssige Tröpfchen in die Nase oder den Mund gelangen. Nach zwei bis drei Minuten die überschüssige Flüssigkeit abtupfen und das Auge mit 0,3% Hypromellose-Gel bedecken. Als nächstes wickeln Sie die Maus in eine Schicht chirurgischer Gaze, um die Körperwärme zu erhalten, legen Sie die Maus dann auf die Tierkassette und positionieren Sie den Kopf mit der Bissleiste.
Um die optische Kohärenztomographie oder OCT-Bilder zu erfassen, schalten Sie das OCT-Bildgebungssystem ein, und öffnen Sie die Bildgebungssoftware. Für die Hinterkammerbildgebung bringen Sie das OCT nahe an die Augenoberfläche und achten Sie darauf, die Oberfläche der Linse nicht mit dem Auge in Kontakt zu bringen. Sobald das Auge richtig positioniert ist, stoppen Sie den schnellen Scan, wählen Sie das Volume-Scan-Protokoll und aktivieren Sie den Scan mit der Zieloption.
Passen Sie bei Bildern des hinteren Segments an, bis der Sehnerv im horizontalen B-Scan-Ausrichtungsbild zentriert ist und die Netzhaut mit der vertikalen Ausrichtungsachse ausgerichtet ist. Passen Sie bei Bildern des vorderen Segments die Position so an, dass die Spitze der Hornhaut sowohl im horizontalen B-Scan-Ausrichtungsbild als auch im vertikalen B-Scan-Ausrichtungsbild zentriert wird. Klicken Sie abschließend auf Snapshot, um das Volume-Scan-Image aufzunehmen, und klicken Sie dann auf Speichern.
24 Stunden nach der intravitrealen Injektion werden Entzündungszellen im wässrigen und glasigen Gewebe gesehen. Hornhautödem, ein Hypopyon und mehrere frei schwebende Entzündungszellen sind in der Vorderkammer und Vitritis in der hinteren Kammer zu sehen. Der Grad der Augenentzündung kann auf diesen OCT-Bildern bewertet werden.
Kombinierte Werte größer als Null, aber weniger als 2,5 stellen eine leichte Entzündung dar. Werte größer als 2,5, aber kleiner als 4,5. eine moderate Entzündung darstellen und Werte von mehr als 4,5 eine schwere Entzündung kennzeichnen.
Entzündungswerte können auch anhand von fünf Merkmalen bestimmt werden, die in Hämatoxylin- und Eosin-Färbeabschnitten sichtbar sind. Der Schweregrad wird durch Zählen der Anzahl der Entzündungszellen im wässrigen und glasigen Bereich bestimmt. Die Hellfeld-Longitudinal-Fundus-Bildgebung kann auch Netzhaut- und perivaskuläre Entzündungen identifizieren.
Stark entzündete Augen zeigen mehrere weiße Infiltrate in der Netzhaut und vaskuläre Tortuosität bei der Farbfundusbildgebung sowie dichte Vitritis und Netzhautödeme am zweiten Oktober. Leicht entzündete Augen zeigen weniger und diskretere lineare Läsionen im Fundus und eine Reihe von infiltrierenden Zellen im Glaskörperraum. Die Sicherstellung der Konsistenz während der subkutanen und intravitrealen Injektionen und das Ergreifen geeigneter Maßnahmen zur Verhinderung der Entwicklung einer infektiösen Endophthalmitis sind die wichtigsten Schritte, die zur erfolgreichen Replikation dieses Modells beitragen.
In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung kann zur Charakterisierung von Entzündungen verwendet werden, während Post-Mortem-Assays, wie Multiparameter-, Durchflusszytometrie-Analysen durchgeführt werden können, um infiltrierende Immunzelltyppopulationen zu identifizieren und zu quantifizieren. Zytokinanalyse, mRNA-Sequenzierung und Immunfluoreszenzbildgebung können verwendet werden, um Gen- und Proteinexpressionsmuster zu beurteilen oder retinale Immunzellpopulationen bei Uveitis zu identifizieren. Dieses Protokoll zeigt, wie reproduzierbare, aseptische und minimal traumatische Injektionen durchgeführt werden können, die zukünftigen Forschern den Zugang zum intravitrealen Raum bei Mäusen erleichtern werden.
OCT wird auch eine wichtige Rolle bei der Erkennung von Augenentzündungen spielen, die sonst durch eine visuelle Untersuchung der Augen von kleinen Versuchstieren übersehen werden könnten.
