פרוטוקול זה מתווה את השלבים לגרימת דלקת עיניים אמינה וחזקה באמצעות מיקובקטריה מומת בחום במודל העכבר. מודל זה של אובאיטיס מיקובקטריאלית יכול לעזור לחקור את המנגנונים של דלקת עיניים כרונית המתווכת על ידי מערכת החיסון המתפתחת לאחר זיהום מיקובקטריאלי. מודל זה של אובאיטיס כרונית אינו דורש שימוש בזני עכבר ספציפיים או חיסון עם אנטיגנים עיניים.
מודל זה מקל על השימוש בקווי עכברים מהונדסים וגנים נוקאאוט במחקרים מכניסטיים של הפתוגנזה של דלקת עיניים. מודל PMU זה יעזור במחקרים הבודקים טיפולים חדשים לדלקת עיניים או אובאיטיס בבני אדם. טיפולים כגון טיפות עיניים חדשות או חומרים מווסתים חיסונית הניתנים באופן סיסטמי יכולים להיבדק ליעילות עם מודל זה.
מודל זה יקל על חקר האופן שבו אנטיגנים מיקובקטריאליים המומתים מחום משנים את המיקרו-סביבה של איבר מיוחס למערכת החיסון כמו העין. התוצאות האלה יכולות גם לספק תובנות על האופן שבו סוגים אחרים של זיהום בעיניים משפיעים על העין, או על האופן שבו אתרים מיוחסים למערכת החיסון, כמו המוח, מגיבים לאנטיגנים מיקרובקטריאליים. כדי להתחיל, בטל את הידוק הגוף של יחידת הממיר של Sonicator ונקה את הבדיקה עם ספוגית 70% אלכוהול.
לאחר מכן הפעל את Sonicator וכוונן את הגדרת צריכת החשמל לארבע על ידי סיבוב ידית בקרת החשמל. לאחר מכן, כדי ליצור תרחיף עדין של שחפת המיקרובקטריום H37Ra ב-PBS, טבלו את קצה הבדיקה לתוך אבקת המיקרובקטריאלים המכילה PBS. סונו את התערובת על קרח למשך 30 שניות, ואז השהו למשך 30 שניות וחזרו על הפעולה במשך חמש דקות בסך הכל כדי לפזר את האבקה במלואה לתרחיף אחיד מבלי לחמם את הנוזל.
לאחר מכן, מוסיפים לתערובת 2.5 מיליליטר של אדג'ובנט לא שלם של פרוינד, וחוזרים על תהליך הסוניקציה על הקרח עד שהתחליב יוצר מרקם דמוי משחת שיניים. עבור הזרקה תת עורית, לטעון 200 עד 300 microliters של תחליב מיקרובקטריאלי במזרק מיליליטר אחד. מוציאים את האוויר מהמזרק וממשיכים למלא את המזרק בהיפוך והקשה לסירוגין עד למילוי.
לאחר מכן, הנח את הזריקות התת עוריות על המשטח הגבי של הירכיים או על פני השטח הגחוניים של הרגליים פרוקסימליות לאזור בלוטות הלימפה המפשעות של עכבר C57 שחור 6J מורדם בן 6 עד 10 שבועות. בזהירות להחדיר את המחט, נזהר לא לחדור את השריר, ולהזריק 50 microliters של תחליב לתוך החלל תת עורית. אין להסיר את המחט באופן מיידי כדי לאפשר הזרקה מלאה של האמולסיה.
כדי להכין את מלאי האנטיגן להזרקה intravitreal, סוניקו את H37Ra בתמיסת PBS כפי שהוכח קודם לכן, ולאחר מכן aliquot את התמיסה בנפחים של 100 מיקרוליטר ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס. ביום ההזרקה, לאחר אישור עומק ההרדמה הכללית, מרדימים את הקרנית בטיפה אחת של 0.5% טטרקאין ומרחיבים את האישון בטיפה אחת של 2.5% פנילפרין. לאחר סילוק עודפי נוזלים, יש להוסיף טיפה אחת של 5% בטאדין לפני השטח של העין והשיער שמסביבה כדי להפחית את הסיכון לאנדופתלמיטיס.
לאחר שתיים עד שלוש דקות, הסר את הבטאדין וכסה את העין בג'ל היפרומלוז 0.3% כדי למנוע יובש תחת הרדמה והיווצרות קטרקט. לאחר מכן, טען מזרק של 10 מיקרוליטר עם תערובת האנטיגן והפלואורסצין, ולאחר מכן הנח את העכבר במצב נוטה על הפלטפורמה והשתמש במוטות האוזן הימנית והשמאלית כדי לתקן את ראש העכבר. מקם וכיוון את העכבר מתחת לטווח כך שהיבט האף העליון של עין ימין נראה לעין.
לאחר מכן, באמצעות מחט 30 מד, לעקור את הריסים, לחשוף את סקלרה, ולדמיין את הלימבוס ואת כלי הדם הרדיאלי. לאחר מכן, באמצעות מחט סטרילית 30 מד, לעשות חור מדריך בסקלרה אחד עד שני מילימטר אחורי ללימבוס. לאחר מכן, הכנס את מחט 34 המדידה המחוברת למחזיק ההזרקה לתוך העין, דרך חור המנחה, בזווית שתמנע את העדשה, אך הנח את קצה המחט לתוך חלל הזגוגית.
באמצעות בקר משאבת מזרק מיקרו, להזריק בזהירות מיקרוליטר אחד של תמצית M.tuberculosis לתוך חלל הזגוגית. במקרה של ריפלוקס עקבי, הגדל את נפח ההזרקה ל -1.5 מיקרוליטר כדי להבטיח מתן מינון הולם. אשר את המיקום intravitreal על ידי הדמיה רפלקס ירקרק בעין, ולאחר 10 שניות, להסיר את המחט מהעין.
לאחר הרדמת העכבר, להרחיב את האישון עם טיפה אחת של 2.5% פנילפרין, הימנעות טיפות עודף נכנס לאף או לפה. לאחר 2-3 דקות, יש למרוח את עודפי הנוזלים ולכסות את העין בג'ל היפרומלוז של 0.3%. לאחר מכן, לעטוף את העכבר בשכבה של גזה כירורגית כדי לשמור על חום הגוף, ולאחר מכן להניח את העכבר על קלטת החיה ולמקם את הראש עם חטיף הנשיכה.
כדי לרכוש טומוגרפיה קוהרנטית אופטית או תמונות OCT, הפעל את מערכת ההדמיה OCT ופתח את תוכנת ההדמיה. להדמיית החדר האחורי, קרבו את ה-OCT לפני השטח של העין, תוך הקפדה שלא להביא את פני השטח של העדשה במגע עם העין. לאחר שהעין ממוקמת כראוי, הפסק את הסריקה המהירה, בחר את פרוטוקול סריקת אמצעי האחסון והפעל את הסריקה באמצעות האפשרות מטרה.
לתמונות מקטעים אחוריים, התאימו את עצמכם עד שעצב הראייה יהיה ממורכז בתמונת יישור הסריקה האופקית B, והרשתית תהיה מיושרת עם ציר היישור האנכי. לתמונות מקטע קדמי, התאימו את המיקום למרכז הקרנית הן בתמונת היישור האופקית של סריקת B והן בתמונת היישור האנכית של סריקת B. לבסוף, לחץ על Snapshot כדי ללכוד את תמונת סריקת עוצמת הקול, ולאחר מכן לחץ על שמור.
24 שעות לאחר ההזרקה התוך-גופית, תאי דלקת נראים בזגוגית המימית והזגוגית. בצקת קרנית, היפופיון, ותאי דלקת רבים שצפים בחופשיות נראים בתא הקדמי, ודלקת ויטריטיס בתא האחורי. ניתן להבקיע את מידת הדלקת בעיניים בתמונות OCT אלה.
ציונים משולבים גבוהים מאפס אך פחות מ-2.5 מייצגים דלקת קלה. ציונים גדולים מ-2.5, אך פחות מ-4.5. מייצגים דלקת מתונה, וציונים גבוהים מ-4.5 מזהים דלקת חמורה.
ניתן לקבוע את ציוני הדלקת גם באמצעות חמישה מאפיינים הנראים במקטעי כתמי המטוקסילין ואאוזין. ציון החומרה נקבע על ידי ספירת מספר תאי הדלקת בזגוגית המימית והזגוגית. הדמיית פונדוס אורכית של ברייטפילד יכולה גם לזהות דלקת ברשתית ובכלי הדם.
עיניים מודלקות קשות מדגימות חדירות לבנות מרובות ברשתית ובטורטואוז כלי הדם בהדמיית פונדוס צבע, כמו גם דלקת ויטריטיס צפופה ובצקת רשתית ב- OCT ביום השני. עיניים מודלקות קלות מדגימות פחות ויותר נגעים ליניאריים דיסקרטיים בפונדוס, ומספר תאים מסתננים בחלל הזגוגית. הבטחת עקביות במהלך זריקות תת עורית ו intravitreal ונקיטת אמצעים מתאימים כדי למנוע התפתחות של אנדופתלמיטיס זיהומיות הם הצעדים העיקריים המסייעים בהצלחה לשכפל מודל זה.
ניתן להשתמש בהדמיית ביולומינסנציה in vivo כדי לאפיין דלקת בעוד שבדיקות שלאחר המוות, כמו ריבוי פרמטרים, ניתן לבצע ניתוח ציטומטרי של זרימה כדי לזהות ולכמת אוכלוסיות מסוג תאי חיסון מסתננים. ניתן להשתמש בניתוח ציטוקינים, ריצוף mRNA והדמיית אימונופלואורסצנציה כדי להעריך דפוסי ביטוי של גנים וחלבונים או לזהות אוכלוסיות של תאי חיסון ברשתית באובאיטיס. פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע זריקות הניתנות לשחזור, אספטי וטראומטי מינימלי שיסייעו לחוקרים עתידיים לגשת לחלל התוך-ויטריוני בעכברים.
OCT גם ימלא תפקיד חשוב באיתור דלקת עיניים שאחרת עלולה להתפספס על ידי בדיקה חזותית של עיניהם של חיות ניסוי קטנות.
