Ce protocole décrit les étapes à suivre pour induire une inflammation oculaire fiable et robuste à l’aide de mycobactéries tuées par la chaleur dans le modèle murin. Ce modèle d’uvéite mycobactérienne amorcée peut aider à étudier les mécanismes de l’inflammation oculaire chronique à médiation immunitaire qui se développe après une infection mycobactérienne. Ce modèle d’uvéite chronique ne nécessite pas l’utilisation de souches de souris spécifiques ou l’immunisation avec des antigènes oculaires.
Ce modèle facilite l’utilisation de lignées de souris transgéniques et génétiquement knockout dans les études mécanistiques de la pathogenèse de l’inflammation oculaire. Ce modèle PMU sera utile dans les études testant de nouvelles thérapies pour l’inflammation oculaire ou l’uvéite chez l’homme. Des traitements tels que de nouvelles gouttes ophtalmiques ou des agents immunomodulateurs administrés par voie systémique pourraient être testés pour leur efficacité avec ce modèle.
Ce modèle facilitera l’étude de la façon dont les antigènes mycobactériens tués par la chaleur modifient le microenvironnement d’un organe immunitaire privilégié comme l’œil. Ces résultats pourraient également fournir des informations sur la façon dont d’autres types d’infections oculaires affectent l’œil ou comment les sites privilégiés immunitaires, comme le cerveau, répondent aux antigènes microbactériens. Pour commencer, décollez le corps de l’unité de conversion Sonicator et nettoyez la sonde avec un tampon d’alcool à 70%.
Ensuite, allumez le Sonicator et réglez le réglage d’alimentation à quatre en tournant le bouton de contrôle de l’alimentation. Ensuite, pour générer une suspension fine de la microbactérie tuberculeuse H37Ra dans du PBS, immergez la pointe de la sonde dans la poudre microbactérienne contenant du PBS. Sonicer le mélange sur de la glace pendant 30 secondes, puis faire une pause de 30 secondes et répéter pendant un total de cinq minutes pour disperser complètement la poudre en une suspension uniforme sans chauffer le liquide.
Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres d’adjuvant incomplet de Freund au mélange et répétez le processus de sonication sur la glace jusqu’à ce que l’émulsion forme une consistance semblable à celle d’un dentifrice. Pour l’injection sous-cutanée, chargez 200 à 300 microlitres de l’émulsion microbactérienne dans une seringue d’un millilitre. Expulser l’air de la seringue et continuer à remplir la seringue avec une inversion et un tapotement intermittents jusqu’à ce qu’elle soit remplie.
Ensuite, placez les injections sous-cutanées sur la surface dorsale des hanches ou sur la surface ventrale des jambes proximale à la région des ganglions lymphatiques inguinaux d’une souris noire 6J anesthésiée de 6 à 10 semaines. Insérez soigneusement l’aiguille en prenant soin de ne pas pénétrer dans le muscle et injectez 50 microlitres de l’émulsion dans l’espace sous-cutané. Ne retirez pas l’aiguille immédiatement pour permettre à l’émulsion épaisse d’être complètement injectée.
Pour préparer le stock d’antigène pour l’injection intravitréenne, sonicer le H37Ra dans une solution PBS comme démontré précédemment, puis aliquoter la solution dans des volumes de 100 microlitres et stocker à 20 degrés Celsius. Le jour de l’injection, après avoir confirmé la profondeur de l’anesthésie générale, anesthésiez la cornée avec une goutte de 0,5% de tétracaïne et dilatez la pupille avec une goutte de 2,5% de phényléphrine. Après avoir tamponné l’excès de liquide, ajoutez une goutte de 5% de bétadine à la surface de l’œil et des cheveux environnants pour réduire le risque d’endophtalmie.
Après deux à trois minutes, retirez la bétadine et couvrez l’œil avec du gel d’hypromellose à 0,3% pour prévenir la sécheresse sous anesthésie et la formation de cataracte. Ensuite, chargez une seringue de 10 microlitres avec le mélange d’antigène et de fluorescéine, puis placez la souris en position couchée sur la plate-forme et utilisez les barres d’oreille droite et gauche pour fixer la tête de la souris. Positionnez et orientez la souris sous la lunette de manière à ce que l’aspect nasal supérieur de l’œil droit soit visible.
Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 30, déplacez les cils, exposez la sclère et visualisez le limbe et le vaisseau sanguin radial. Ensuite, à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 30, faites un trou de guidage dans la sclérotique d’un à deux millimètres postérieurs au limbe. Ensuite, insérez l’aiguille de calibre 34 fixée au porte-injection dans l’œil, à travers le trou de guidage, à un angle qui évitera la lentille, mais placez la pointe de l’aiguille dans la cavité vitrée.
À l’aide d’un contrôleur de pompe à micro-seringue, injectez soigneusement un microlitre d’extrait de M. tuberculosis dans la cavité vitrée. En cas de reflux constant, augmenter le volume d’injection à 1,5 microlitre pour assurer une administration adéquate de la dose. Confirmez le placement intravitréen en visualisant un réflexe verdâtre dans l’œil et, après 10 secondes, retirez l’aiguille de l’œil.
Après avoir anesthésié la souris, dilatez la pupille avec une goutte de phényléphrine à 2,5%, en évitant que les gouttelettes en excès ne pénètrent dans le nez ou la bouche. Après deux à trois minutes, tamponnez l’excès de liquide et couvrez l’œil avec du gel d’hypromellose à 0,3%. Ensuite, enveloppez la souris dans une couche de gaze chirurgicale pour maintenir la chaleur du corps, puis placez la souris sur la cassette de l’animal et positionnez la tête avec la barre de morsure.
Pour acquérir les images de tomographie par cohérence optique ou d’OCT, allumez le système d’imagerie OCT et ouvrez le logiciel d’imagerie. Pour l’imagerie de la chambre postérieure, approchez l’OCT de la surface de l’œil, en prenant soin de ne pas mettre la surface du cristallin en contact avec l’œil. Une fois l’œil correctement positionné, arrêtez l’analyse rapide, sélectionnez le protocole de balayage du volume et activez l’analyse avec l’option Viser.
Pour les images du segment postérieur, ajustez jusqu’à ce que le nerf optique soit centré dans l’image d’alignement du balayage horizontal B et que la rétine soit alignée sur l’axe d’alignement vertical. Pour les images du segment antérieur, ajustez la position pour centrer l’apex de la cornée dans l’image d’alignement B-scan horizontal et l’image d’alignement B-scan vertical. Enfin, cliquez sur Snapshot pour capturer l’image de numérisation du volume, puis cliquez sur enregistrer.
24 heures après l’injection intravitréenne, des cellules inflammatoires sont observées dans l’aqueux et le vitré. Un œdème cornéen, un hypopyon et de multiples cellules inflammatoires flottantes librement sont observés dans la chambre antérieure et une vitrite dans la chambre postérieure. Le degré d’inflammation oculaire peut être noté sur ces images OCT.
Les scores combinés supérieurs à zéro mais inférieurs à 2,5 représentent une inflammation légère. Scores supérieurs à 2,5, mais inférieurs à 4,5. représentent une inflammation modérée, et les scores supérieurs à 4,5 identifient une inflammation grave.
Les scores d’inflammation peuvent également être déterminés à l’aide de cinq caractéristiques visibles dans les sections de coloration d’hématoxyline et d’éosine. Le score de gravité est déterminé en comptant le nombre de cellules inflammatoires dans l’aqueux et le vitré. L’imagerie longitudinale du fond d’œil à fond clair permet également d’identifier l’inflammation rétinienne et périvasculaire.
Les yeux gravement enflammés présentent de multiples infiltrats blancs dans la rétine et une tortuosité vasculaire sur l’imagerie du fond d’œil couleur, ainsi qu’une vitrite dense et un œdème rétinien le deuxième jour. Les yeux légèrement enflammés présentent des lésions linéaires moins nombreuses et plus discrètes dans le fond d’œil, et un certain nombre de cellules infiltrantes dans l’espace vitré. Assurer la cohérence lors des injections sous-cutanées et intravitrées et prendre les mesures appropriées pour prévenir le développement de l’endophtalmie infectieuse sont les étapes clés qui aident à reproduire avec succès ce modèle.
L’imagerie par bioluminescence in vivo peut être utilisée pour caractériser l’inflammation, tandis que des tests post-mortem, comme l’analyse cytométrique en flux multiparamètre, peuvent être effectués pour identifier et quantifier les populations de type cellulaire immunitaire infiltrantes. L’analyse des cytokines, le séquençage de l’ARNm et l’imagerie par immunofluorescence peuvent être utilisés pour évaluer les profils d’expression des gènes et des protéines ou identifier les populations de cellules immunitaires rétiniennes dans l’uvéite. Ce protocole montre comment effectuer des injections reproductibles, aseptiques et mini-traumatiques qui aideront les futurs chercheurs à accéder à l’espace intravitréen chez la souris.
La TCO jouera également un rôle important dans la détection de l’inflammation oculaire qui pourrait autrement être manquée par un examen visuel des yeux de petits animaux de laboratoire.
