Bu protokol, fare modelinde ısıl öldürücü mikobakterileri kullanarak güvenilir ve sağlam oküler inflamasyonu indükleme adımlarını özetlemektedir. Bu astarlanmış mikobakteriyel üveit modeli, mikobakteriyel bir enfeksiyondan sonra gelişen kronik immün aracılı oküler inflamasyonun mekanizmalarını incelemeye yardımcı olabilir. Bu kronik üveit modeli, spesifik fare suşlarının kullanılmasını veya oküler antijenlerle bağışıklamayı gerektirmez.
Bu model, oküler inflamasyonun patogenezinin mekanik çalışmalarında transgenik ve gen nakavt fare çizgilerinin kullanımını kolaylaştırır. Bu PMU modeli, insanlarda oküler inflamasyon veya üveit için yeni tedavileri test eden çalışmalarda yardımcı olacaktır. Yeni göz damlaları veya sistemik olarak uygulanan immün modülatör ajanlar gibi tedaviler bu modelle etkinlik açısından test edilebilir.
Bu model, ısıda öldürülen mikobakteriyel antijenlerin, göz gibi bağışıklık ayrıcalıklı bir organın mikro ortamını nasıl değiştirdiğini incelemeyi kolaylaştıracaktır. Bu sonuçlar ayrıca, diğer oküler enfeksiyon türlerinin gözü nasıl etkilediği veya beyin gibi bağışıklık ayrıcalıklı bölgelerinin mikrobakteriyel antijenlere nasıl tepki verdiği hakkında fikir verebilir. Başlamak için, Sonicator dönüştürücü ünitesinin gövdesini kelepçeleyin ve probu% 70 alkollü çubukla temizleyin.
Ardından Sonicator'ı açın ve güç kontrol düğmesini çevirerek güç ayarını dörde ayarlayın. Daha sonra, PBS'deki mikrobakteri tüberkülozu H37Ra'nın ince bir süspansiyonunu oluşturmak için, probun ucunu PBS içeren mikrobakteriyel toza batırın. Karışımı buz üzerinde 30 saniye boyunca sonikleştirin, ardından 30 saniye duraklatın ve tozu sıvıyı ısıtmadan eşit bir süspansiyona tamamen dağıtmak için toplam beş dakika tekrarlayın.
Daha sonra, karışıma 2,5 mililitre Freund'un Tamamlanmamış Adjuvanını ekleyin ve emülsiyon diş macunu benzeri bir kıvam oluşturana kadar sonikasyon işlemini buz üzerinde tekrarlayın. Subkutan enjeksiyon için, bir mililitrelik bir şırıngaya 200 ila 300 mikrolitre mikrobakteriyel emülsiyon yükleyin. Havayı şırıngadan dışarı atın ve şırıngayı dolana kadar aralıklı ters çevirme ve dokunma ile doldurmaya devam edin.
Daha sonra, deri altı enjeksiyonlarını kalçaların dorsal yüzeyine veya 6 ila 10 haftalık anestezili bir C57 siyah 6J farenin kasık lenf düğümlerinin bölgesine proksimal bacakların ventral yüzeyine yerleştirin. İğneyi dikkatlice yerleştirin, kaslara nüfuz etmemeye dikkat edin ve emülsiyonun 50 mikrolitresini deri altı boşluğuna enjekte edin. Kalın emülsiyonun tamamen enjekte edilmesine izin vermek için iğneyi hemen çıkarmayın.
Antijen stoğunu intravitreal enjeksiyon için hazırlamak için, daha önce gösterildiği gibi PBS çözeltisinde H37Ra'yı sonikleştirin, ardından çözeltiyi 100 mikrolitre hacimlerde aliquot edin ve 20 santigrat derecede saklayın. Enjeksiyon gününde, genel anestezi derinliğini doğruladıktan sonra, korneayı bir damla% 0.5 tetrakain ile uyuşturun ve öğrenciyi% 2.5'lik bir damla% 2.5 fenilefrin ile genişletin. Fazla sıvıyı temizledikten sonra, endoftalmi riskini azaltmak için göz yüzeyine ve çevresindeki saçlara bir damla% 5 Betadine ekleyin.
İki ila üç dakika sonra, Betadine'i çıkarın ve anestezi altında kuruluğu ve katarakt oluşumunu önlemek için% 0.3 hipromeloz jeli ile gözü örtün. Ardından, antijen ve floresein karışımı ile 10 mikrolitrelik bir şırınga yükleyin, ardından fareyi platformda eğilimli bir konuma yerleştirin ve fare kafasını sabitlemek için sağ ve sol kulak çubuklarını kullanın. Fareyi, sağ gözün üstün burun yönü görülebilecek şekilde kapsamın altına yerleştirin ve yönlendirin.
Daha sonra, 30 gauge iğne kullanarak, kirpikleri yerinden oynatın, sklerayı açığa çıkarın ve limbus ve radyal kan damarını görselleştirin. Daha sonra, steril bir 30 gauge iğne kullanarak, sklerada limbusun bir ila iki milimetre arkasından bir kılavuz delik açın. Ardından, enjeksiyon tutucuya bağlı 34 gauge iğneyi, kılavuz deliğinden, lensten kaçınacak bir açıyla gözün içine yerleştirin, ancak iğne ucunu vitreus boşluğuna yerleştirin.
Bir mikro şırınga pompası kontrolörü kullanarak, bir mikrolitre M.tuberculosis ekstraktını vitreus boşluğuna dikkatlice enjekte edin. Tutarlı reflü durumunda, yeterli doz verilmesini sağlamak için enjeksiyon hacmini 1.5 mikrolitreye yükseltin. Gözdeki yeşilimsi bir refleksi görselleştirerek intravitreal yerleşimi onaylayın ve 10 saniye sonra iğneyi gözden çıkarın.
Fareyi anestezi altına aldıktan sonra, göz bebeğini bir damla% 2.5 fenilefrin ile genişletin, burun veya ağıza giren aşırı damlacıkları önleyin. İki ila üç dakika sonra, fazla sıvıyı temizleyin ve% 0.3 hipromeloz jeli ile gözü örtün. Ardından, vücut sıcaklığını korumak için fareyi bir cerrahi gazlı bez tabakasına sarın, ardından fareyi hayvan kasetine yerleştirin ve kafayı ısırık çubuğuyla konumlandırın.
Optik koherens tomografi veya OCT görüntülerini elde etmek için, OCT görüntüleme sistemini açın ve görüntüleme yazılımını açın. Arka kamara görüntüleme için, lensin yüzeyini gözle temas ettirmemeye dikkat ederek OCT'yi göz yüzeyine yaklaştırın. Göz doğru şekilde konumlandırıldıktan sonra, hızlı taramayı durdurun, ses tarama protokolünü seçin ve Amaç seçeneğiyle taramayı etkinleştirin.
Arka segment görüntüleri için, optik sinir yatay B tarama hizalama görüntüsünde ortalanana ve retina dikey hizalama ekseniyle hizalanana kadar ayarlayın. Ön segment görüntüleri için, hem yatay B-tarama hizalama görüntüsünde hem de dikey B-tarama hizalama görüntüsünde korneanın tepesini ortalayacak konumu ayarlayın. Son olarak, birim tarama görüntüsünü yakalamak için Anlık Görüntü'ye tıklayın, ardından kaydet'e tıklayın.
İntravitreal enjeksiyondan 24 saat sonra, sulu ve vitreusta inflamatuar hücreler görülür. Kornea ödemi, hipopyon ve çoklu serbest yüzen inflamatuar hücreler ön kamarada ve vitrit arka kamarada görülür. Oküler inflamasyonun derecesi bu OCT görüntülerinde puanlanabilir.
Sıfırdan büyük ancak 2.5'ten küçük kombine skorlar hafif inflamasyonu temsil eder. 2,5'ten büyük, ancak 4,5'ten küçük puanlar. orta derecede inflamasyonu temsil eder ve 4.5'ten büyük puanlar şiddetli inflamasyonu tanımlar.
Enflamasyon skorları, hematoksilin ve eozin leke kesitlerinde görülebilen beş özellik kullanılarak da belirlenebilir. Şiddet skoru, sulu ve vitreustaki enflamatuar hücrelerin sayısını sayarak belirlenir. Brightfield longitudinal fundus görüntüleme retinal ve perivasküler inflamasyonu da tanımlayabilir.
Şiddetli iltihaplı gözlerde retinada çoklu beyaz infiltrasyonlar ve renkli fundus görüntülemede vasküler kıvrımlılığın yanı sıra ikinci günde OKT'de yoğun vitrit ve retinal ödem görülür. Hafif iltihaplı gözler, fundusta giderek daha az ve daha gizli lineer lezyonlar ve vitreus boşluğunda bir dizi sızan hücre gösterir. Subkutan ve intravitreal enjeksiyonlar sırasında tutarlılığın sağlanması ve enfeksiyöz endoftalmi gelişimini önlemek için uygun önlemlerin alınması, bu modelin başarılı bir şekilde çoğaltılmasına yardımcı olan kilit adımlardır.
İnvivo biyolüminesans görüntüleme inflamasyonu karakterize etmek için kullanılabilirken, infiltrasyon yapan immün hücre tipi popülasyonlarını tanımlamak ve ölçmek için çok parametreli gibi ölüm sonrası testler akış sitometrik analizi yapılabilir. Sitokin analizi, mRNA dizilimi ve immünofloresan görüntüleme, üveitte gen ve protein ekspresyon paternlerini değerlendirmek veya retinal immün hücre popülasyonlarını tanımlamak için kullanılabilir. Bu protokol, gelecekteki araştırmacıların farelerde intravitreal alana erişmelerine yardımcı olacak tekrarlanabilir, aseptik ve minimal travmatik enjeksiyonların nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir.
OCT ayrıca, küçük deney hayvanlarının gözlerinin görsel muayenesi ile kaçırılabilecek oküler inflamasyonun saptanmasında da önemli bir rol oynayacaktır.
