Этот протокол описывает шаги по индуцированию надежного и прочного глазного воспаления с использованием термоубильных микобактерий в мышиной модели. Эта модель первичного микобактериального увеита может помочь изучить механизмы хронического иммунно-опосредованного воспаления глаз, которое развивается после микобактериальной инфекции. Данная модель хронического увеита не требует применения специфических штаммов мышей или иммунизации глазными антигенами.
Данная модель облегчает использование трансгенных и генных нокаутирующих линий мышей в механистических исследованиях патогенеза глазного воспаления. Эта модель PMU будет полезна в исследованиях, тестирующих новые методы лечения глазного воспаления или увеита у людей. Такие методы лечения, как новые глазные капли или системно вводимые иммуномодулирующие агенты, могут быть проверены на эффективность с помощью этой модели.
Эта модель облегчит изучение того, как убитые теплом микобактериальные антигены изменяют микросреду иммунного привилегированного органа, такого как глаз. Эти результаты также могут дать представление о том, как другие типы глазной инфекции влияют на глаз или как иммунные привилегированные участки, такие как мозг, реагируют на микробактериальные антигены. Для начала отсоедините корпус блока преобразователя Sonicator и очистите зонд 70%-ным спиртовым тампоном.
Затем включите Sonicator и отрегулируйте настройку мощности до четырех, повернув ручку управления питанием. Затем, чтобы получить тонкую суспензию микробактерии туберкулеза H37Ra в PBS, погрузите наконечник зонда в PBS-содержащий микробактериальный порошок. Обработайте смесь ультразвуком на льду в течение 30 секунд, затем сделайте паузу на 30 секунд и повторите в общей сложности пять минут, чтобы полностью диспергировать порошок в равномерную суспензию без нагрева жидкости.
Затем добавьте в смесь 2,5 миллилитра неполного адъюванта Фройнда и повторяйте процесс обработки ультразвуком на льду, пока эмульсия не образует консистенцию, похожую на зубную пасту. Для подкожной инъекции нагрузите от 200 до 300 микролитров микробактериальной эмульсии в один миллилитр шприц. Выталкивайте воздух из шприца и продолжайте заполнять шприц прерывистым инвертированием и постукиванием до наполнения.
Затем поместите подкожные инъекции либо на дорсальную поверхность бедер, либо на вентральную поверхность ног проксимально к области паховых лимфатических узлов 6-10-недельной анестезированной черной 6J мыши C57. Осторожно вставьте иглу, следя за тем, чтобы не проникнуть в мышцу, и введите 50 микролитров эмульсии в подкожное пространство. Не удаляйте иглу сразу, чтобы позволить густой эмульсии быть полностью введенной.
Чтобы подготовить запас антигена для интравитреальной инъекции, обработайте ультразвуком H37Ra в растворе PBS, как было продемонстрировано ранее, затем аликвотируйте раствор в объемах 100 микролитров и храните при 20 градусах Цельсия. В день инъекции, после подтверждения глубины общей анестезии, обезболивают роговицу одной каплей 0,5% тетракаина и расширяют зрачок одной каплей 2,5% фенилэфрина. После удаления лишней жидкости добавьте одну каплю 5% бетадина на поверхность глаза и окружающие волосы, чтобы снизить риск эндофтальмита.
Через две-три минуты удалите бетадин и накройте глаз 0,3% гипромеллозным гелем для предотвращения сухости под наркозом и образования катаракты. Затем загрузите 10-микролитровый шприц со смесью антигена и флуоресцеина, затем поместите мышь в положение лежа на платформе и используйте правую и левую ушные перекладины, чтобы зафиксировать головку мыши. Расположите и ориентируйте мышь под прицелом так, чтобы был виден верхний носовой аспект правого глаза.
Затем, используя иглу 30-го калибра, смещают ресницы, обнажают склеры и визуализируют лимб и радиальный кровеносный сосуд. Далее, используя стерильную иглу 30 калибра, сделайте направляющее отверстие в склере на один-два миллиметра сзади от лимбуса. Затем вставьте иглу 34 калибра, прикрепленную к держателю инъекции, в глаз, через направляющее отверстие, под углом, который позволит избежать хрусталика, но поместите кончик иглы в стекловидную полость.
Используя контроллер микрошприцевого насоса, осторожно введите один микролитр экстракта M.tuberculosis в полость стекловидного тела. В случае постоянного рефлюкса увеличьте объем инъекции до 1,5 микролитров, чтобы обеспечить адекватную доставку дозы. Подтвердите интравитреальное размещение, визуализировав зеленоватый рефлекс в глазу, а через 10 секунд удалите иглу из глаза.
После обезболивания мыши расширить зрачок одной каплей 2,5% фенилэфрина, избегая попадания лишних капель в нос или рот. Через две-три минуты смазать лишнюю жидкость и покрыть глаз 0,3% гипромеллозным гелем. Далее оберните мышь слоем хирургической марли для поддержания тепла тела, затем поместите мышь на кассету животного и расположите голову с помощью поклевки.
Чтобы получить оптическую когерентную томографию или изображения OCT, включите систему визуализации OCT и откройте программное обеспечение для визуализации. Для визуализации задней камеры поднесите ОКТ близко к поверхности глаза, следя за тем, чтобы поверхность хрусталика не соприкасалась с глазом. Как только глаз будет правильно позиционирован, остановите быстрое сканирование, выберите протокол сканирования громкости и активируйте сканирование с помощью опции Aim.
Для изображений заднего сегмента настраивайте до тех пор, пока зрительный нерв не будет центрирован в горизонтальном изображении выравнивания сканирования B, а сетчатка не будет выровнена по вертикальной оси выравнивания. Для изображений переднего сегмента отрегулируйте положение, чтобы центрировать вершину роговицы как в горизонтальном изображении выравнивания B-скана, так и в вертикальном изображении выравнивания B-сканирования. Наконец, нажмите «Снимок», чтобы захватить изображение сканирования тома, затем нажмите «Сохранить».
Через 24 часа после интравитреальной инъекции в водном и стекловидном теле наблюдаются воспалительные клетки. Отек роговицы, гипопион и множественные свободно плавающие воспалительные клетки наблюдаются в передней камере, а витрит в задней камере. Степень воспаления глаз может быть оценена на этих изображениях OCT.
Комбинированные баллы больше нуля, но менее 2,5 представляют собой легкое воспаление. Баллы больше 2,5, но меньше 4,5. представляют собой умеренное воспаление, а баллы более 4,5 идентифицируют тяжелое воспаление.
Показатели воспаления также могут быть определены с использованием пяти характеристик, видимых в участках пятен гематоксилина и эозина. Оценка тяжести определяется путем подсчета количества воспалительных клеток в водном и стекловидном теле. Визуализация продольного дна Брайтфилда также может идентифицировать воспаление сетчатки и периваскулярного воспаления.
Сильно воспаленные глаза демонстрируют множественные белые инфильтраты в сетчатке и изгиб сосудов на цветной визуализации глазного дна, а также плотный витрит и отек сетчатки на ОКТ на второй день. Слабо воспаленные глаза демонстрируют все меньше и больше незаметных линейных поражений на глазном дне и ряд инфильтрирующих клеток в стекловидном теле. Обеспечение согласованности во время подкожных и интравитреальных инъекций и принятие соответствующих мер для предотвращения развития инфекционного эндофтальмита являются ключевыми шагами, которые помогают успешно воспроизвести эту модель.
Биолюминесцентная визуализация in vivo может быть использована для характеристики воспаления, в то время как посмертные анализы, такие как многопараметрический, проточный цитометрический анализ, могут быть выполнены для выявления и количественной оценки инфильтрирующих популяций типа иммунных клеток. Анализ цитокинов, секвенирование мРНК и иммунофлуоресцентная визуализация могут быть использованы для оценки паттернов экспрессии генов и белков или идентификации популяций иммунных клеток сетчатки при увеите. Этот протокол показывает, как выполнять воспроизводимые, асептические и минимально травматические инъекции, которые помогут будущим исследователям получить доступ к интравитреальному пространству у мышей.
OCT также будет играть важную роль в обнаружении воспаления глаз, которое в противном случае могло бы быть пропущено при визуальном осмотре глаз мелких экспериментальных животных.
