يوفر هذا البروتوكول نهجا جديدا لتصنيف حالة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية مع مجموعة من المزايا التقنية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا تحقيق تحليل دقة خلية واحدة خالية من تسمية الخلية الحية لحالة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتسليط الضوء على الآليات التي تنظم تكوين الخلايا العصبية للبالغين.
التألق الذاتي أكثر باهتا بكثير مما اعتاد الباحثون على العمل معه العديد من الفلوروفورات. كن واثقا من استخدام قوى ليزر أعلى لجمع بياناتك. سيوضح الإجراء كريس مورو ، طالب دراسات عليا سابق من مختبري.
ابدأ بتكوين المجهر متحد البؤر للتصوير الذاتي الفلوري. انقر فوق 405 Laser واكتب في نافذة البث أسفل قائمة الليزر 405. تابع النقر فوق TD لتجميع صورة ضوئية مرسلة وتعيين قيمة HV لتصور العينة.
اضبط طاقة الليزر على 3.5٪ واضبط الكسب على 75. اضبط التكبير/التصغير على اثنين. بالنسبة لمعلمات المسح متحد البؤر ، اضبط مكث البكسل على 0.5 والدقة على 2048 × 2048 بكسل.
باستخدام عدسة موضوعية غمر الزيت 60X تحت المجال الساطع ، اجعل الخلايا في بؤرة التركيز. انقر فوق منفذ العين للتبديل إلى وضع المسح متحد البؤر. تأكد من توجيه مسار الضوء نحو رأس المسح وتأكد من عدم وجود مكعب مرشح يعيق مسار الضوء.
انقر فوق مسح ضوئي ، ثم ركز على الصورة وانقر فوق التقاط للحصول على صور للتألق الذاتي في الخلايا الجذعية العصبية الهادئة والخلايا الجذعية العصبية النشطة. تأكد من جمع صور أحادية المستوى مع سيتوبلازم الخلايا في بؤرة التركيز للحصول على مقطع عرضي تمثيلي لكل خلية. ابدأ التصوير بقوى ليزر منخفضة وقم بزيادة الطاقة تدريجيا حتى يمكن اكتشاف إشارة التألق الذاتي دون التسبب في التشبع.
تحليل الخلايا الجذعية العصبية الهادئة والخلايا الجذعية العصبية النشطة باستخدام مقياس التدفق الخلوي باستخدام فوهة 130 ميكرومتر. تطبيق الظروف البصرية وفقا لقدرات الجهاز واكتشاف التألق الذاتي المنقط. اجمع ما لا يقل عن 10,000 qNSCs و aNSCs مفردة في ملف بيانات.
استخدم هذه البيانات لتصميم بوابات لجمع مجموعة سكانية غنية من qNSCs أو aNSCs. ثم قم بفرز الخلايا المفردة إلى آبار مطلية بطبقة من مادة PLO مملوءة بوسط aNSC. بعد FACS ، اسمح للخلايا الجذعية العصبية بالحضانة لمدة ثلاث ساعات.
لإصلاح الخلايا ، أضف 4٪ بارافورمالدهايد ، مع التأكد من أنه يكفي لتغطية قاع الطبق واحتضانه. بعد 15 دقيقة ، قم باختراق الخلايا بنسبة 0.25٪ تريتون في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، عالج الخلايا بمحلول تلطيخ EdU في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، اغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها باستخدام PBS. ابدأ باستخدام العينين لتحديد مجال الرؤية المناسب وضبط مسار الضوء على العينة على المجهر لتمكين التصوير في الظلام باستخدام الفوتون المتعدد. إعداد لمجموعة صور القناة الأولى.
انتقل إلى علامة تبويب كسب الطاقة واضبط الكسب على PMT إلى 800. انقر فوق علامة التبويب 2P Laser وحدد 750 نانومتر للطول الموجي لليزر وتأكد من استخدام مكعب المرشح الصحيح. لتجميع صورة القناة الأولى ، انقر فوق علامة التبويب Power Gain وقم بتعيين Pockels إلى 30.
ثم انتقل إلى قسم المسح الضوئي في الشاشة وانقر فوق المسح المباشر لبدء وضع المعاينة. قم بزيادة Pockels بشكل تدريجي لتحقيق مجال رؤية مناسب عند طاقة ليزر منخفضة. بمجرد تحديد مجال رؤية مناسب ، اضبط طاقة الليزر على 3.6 مللي واط.
ثم انتقل إلى قسم المسح وانقر فوق مسح ضوئي واحد لالتقاط قناة صورة واحدة خلال 60 ثانية. لجمع صورة القناة الثانية ، انقر فوق علامة التبويب 2P Laser وحدد 890 نانومتر لليزر. استبدل مكعب المرشاح بمكعب الإرسال في القناة الثانية.
بدء وضع المعاينة. قم بزيادة Pockels حتى يظهر عداد الطاقة ما يقرب من سبعة مللي واط ويكون عدد العقود مقابل الفروقات بين 10،000 و 100،000. انقر فوق مسح واحد والتقط صورة قناة اثنتين لمدة 60 ثانية.
تم استخدام التصوير الفلوري الذاتي متحد البؤر للتمييز بين الخلايا الجذعية العصبية الهادئة والخلايا الجذعية العصبية المنشطة. وجد أن qNSCs تعرض عددا أكبر من PAF من aNSCs ، مما يدل على استخدام التألق الذاتي كعلامة لتحديد حالة الخلية. باستخدام FACS ، تم إثراء حالات خلايا NSC بناء على التألق الذاتي.
أظهرت الخلايا التي تم فرزها من بوابة التألق الذاتي العالية معدل انتشار أقل مقارنة بالعينة المختلطة ، في حين أن تلك الموجودة من بوابة التألق الذاتي المنخفضة كانت أكثر تكاثرا ، مما يؤكد تخصيب حالات تنشيط NSC. علاوة على ذلك ، تم استخدام FLIM لتقييم التألق الذاتي NSC وتمييز حالة تنشيط NSCs. والجدير بالذكر أن qNSCs أظهرت متوسط عمر أعلى للتألق في القناة الأولى ، ولكن نسبة أقل من مكون التألق ألفا واحد مقارنة ب aNSCs.
أسفر نموذج الانحدار اللوجستي الذي يتضمن بيانات من كلتا القناتين عن قدرة تنبؤية شبه مثالية لحالات تنشيط NSC كما هو موضح في منحنى خاصية مشغل المستقبل الذي يؤكد إمكانات FLIM في تصنيف حالات NSC. باتباع هذا الإجراء ، سيكون من الجيد التحقق من صحة النتائج باستخدام طرق أخرى لقياس حالة تنشيط الخلايا الجذعية العصبية.
