이 프로토콜은 기술적 이점 코호트와 함께 신경 줄기 세포 활성화 상태를 분류하는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하면 신경 줄기 세포 활성화 상태에 대한 살아있는 세포 표지가 없는 단일 세포 해상도 분석을 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 성인 신경 발생을 조절하는 메커니즘을 밝히는 데 사용할 수 있습니다.
자가형광은 연구자들이 작업하는 데 익숙한 많은 형광단보다 훨씬 어둡습니다. 더 높은 레이저 출력을 사용하여 데이터를 수집하는 데 자신감을 가질 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 전 대학원생인 Chris Morrow입니다.
먼저 자가형광 이미징을 위해 컨포칼 현미경을 구성합니다. 405 레이저를 클릭하고 405 레이저 메뉴 아래의 방출 창에 입력합니다. TD를 클릭하여 투과광 이미지를 수집하고 HV 값을 설정하여 샘플을 시각화합니다.
레이저 출력을 3.5%로 조정하고 게인을 75로 설정합니다. 확대/축소를 2로 설정합니다. 컨포칼 스캐닝 매개변수의 경우 픽셀 드웰을 0.5로 설정하고 해상도를 2048 x 2048 픽셀로 설정합니다.
명시야 아래에서 60X 오일 이멀젼 대물 렌즈를 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다. 아이 포트(Eye Port)를 클릭하여 컨포칼 스캐닝 모드로 전환합니다. 광 경로가 스캔 헤드 쪽으로 향하는지 확인하고 광 경로를 방해하는 필터 큐브가 없는지 확인합니다.
Scan(스캔)을 클릭한 다음 이미지에 초점을 맞추고 Capture(캡처)를 클릭하여 정지 신경 줄기 세포 및 활성 신경 줄기 세포의 자가형광 이미지를 획득합니다. 각 세포의 대표 단면에 대해 초점이 맞춰진 세포의 세포질이 있는 단일 평면 이미지를 수집해야 합니다. 낮은 레이저 출력으로 이미징을 시작하고 포화를 일으키지 않고 자가형광 신호를 감지할 수 있을 때까지 출력을 점차적으로 증가시킵니다.
130마이크로미터 노즐을 사용하는 유세포 분석기로 정지 신경 줄기 세포와 활성 신경 줄기 세포를 분석합니다. 기기의 기능에 따라 광학 조건을 적용하고 반점 자가형광을 감지합니다. 데이터 파일에 최소 10,000개의 singlet qNSC 및 aNSC를 수집합니다.
이 데이터를 활용하여 qNSC 또는 aNSC의 농축된 모집단을 수집하기 위한 게이트를 설계합니다. 그런 다음 singlet cell을 aNSC 매체로 채워진 PLO 라미닌 코팅 웰로 분류합니다. FACS 후 신경 줄기 세포가 3시간 동안 배양되도록 합니다.
세포를 고정하려면 4%의 파라포름알데히드를 추가하여 접시 바닥을 덮고 배양하기에 충분한지 확인합니다. 15분 후 실온에서 15분 동안 PBS에서 0.25%Triton으로 세포를 투과시킵니다. 그런 다음 EdU 염색 용액으로 실온에서 30분 동안 세포를 처리합니다.
다음으로, PBS로 샘플을 각각 10분 동안 3회 세척합니다. 먼저 접안렌즈를 사용하여 적절한 시야를 찾고 현미경에서 샘플에 대한 광 경로를 조정하여 다광자로 어두운 곳에서 이미징할 수 있도록 합니다. 채널 1 이미지 컬렉션을 설정합니다.
전력 게인 탭으로 이동하여 PMT의 게인을 800으로 조정합니다. 2P 레이저 탭을 클릭하고 레이저 파장으로 750나노미터를 선택하고 올바른 필터 큐브가 사용되었는지 확인합니다. 채널 1 이미지를 수집하려면 파워 게인 탭을 클릭하고 포켈을 30으로 설정합니다.
그런 다음 화면의 스캔 섹션으로 이동하여 라이브 스캔을 클릭하여 미리보기 모드를 시작합니다. 낮은 레이저 출력에서 적절한 시야를 얻기 위해 Pockels를 점진적으로 증가시킵니다. 적절한 시야가 확인되면 레이저 출력을 3.6밀리와트로 조정하십시오.
그런 다음 스캔 섹션으로 이동하여 단일 스캔을 클릭하여 60초 동안 채널 1 이미지를 캡처합니다. 채널 2 이미지를 수집하려면 2P 레이저 탭을 클릭하고 레이저로 890나노미터를 선택합니다. 필터 큐브를 채널 2 방출 큐브로 교체합니다.
미리보기 모드를 시작합니다. 파워 미터가 약 7 밀리 와트를 표시하고 CFD 카운트가 10, 000에서 100, 000 사이가 될 때까지 Pockels를 늘립니다. 단일 스캔을 클릭하고 60초 동안 채널 2 이미지를 캡처합니다.
정지 신경 줄기 세포와 활성화된 신경 줄기 세포를 구별하기 위해 공초점 자가형광 이미징이 사용되었습니다. qNSC는 aNSC보다 더 많은 수의 PAF를 표시하는 것으로 나타났으며, 이는 세포 상태 식별을 위한 마커로 자가형광을 사용한다는 것을 보여줍니다. FACS를 사용하여 자가형광을 기반으로 NSC 세포 상태를 강화했습니다.
높은 자가형광 게이트에서 분류된 세포는 혼합 샘플에 비해 더 낮은 증식 속도를 보인 반면, 낮은 자가형광 게이트에서 분류된 세포는 증식성이 더 높았으며, 이는 NSC 활성화 상태의 농축을 확인했습니다. 또한, FLIM은 NSC 자가형광을 평가하고 NSC의 활성화 상태를 식별하는 데 활용되었습니다. 특히 qNSC는 채널 1에서 형광의 평균 수명이 더 높았지만, 형광 성분 알파 1의 비율은 aNSC에 비해 낮았습니다.
두 채널의 데이터를 통합한 로지스틱 회귀 모델은 수신기 운영자 특성 곡선으로 표시된 대로 NSC 활성화 상태에 대한 거의 완벽한 예측 능력을 산출했으며, 이는 NSC 상태를 분류하는 데 있어 FLIM의 잠재력을 강조합니다. 이 절차에 따라 신경 줄기 세포 활성화 상태를 측정하기 위해 다른 접근 방식을 사용하여 결과를 검증하는 것이 좋습니다.
