Этот протокол обеспечивает новый подход к классификации состояния активации нейронных стволовых клеток с когортой технических преимуществ. Используя этот протокол, мы можем достичь анализа состояния активации нейронных стволовых клеток без меток в одной клетке. Этот протокол может быть использован для того, чтобы пролить свет на механизмы, регулирующие нейрогенез взрослых.
Автофлуоресценция намного тусклее, чем многие флуорофоры, с которыми исследователи привыкли работать. Будьте уверены в использовании более высокой мощности лазера для сбора данных. Демонстрировать процедуру будет Крис Морроу, бывший аспирант моей лаборатории.
Начните с настройки конфокального микроскопа для автофлуоресцентной визуализации. Нажмите кнопку 405 Лазер и введите текст в окне излучения в меню 405 лазера. Затем нажмите TD для сбора изображения проходящего света и установите значение HV для визуализации образца.
Отрегулируйте мощность лазера на 3,5% и установите коэффициент усиления на 75. Установите зум на два. Для параметров конфокального сканирования установите задержку пикселей на 0,5 и разрешение на 2048 на 2048 пикселей.
Используя объектив с масляным погружением 60X под светлым полем, сфокусируйте ячейки. Нажмите «Глазной порт», чтобы переключиться в режим конфокального сканирования. Убедитесь, что световой путь направлен в сторону сканирующей головки, и убедитесь, что фильтрующий куб не загораживает световой путь.
Нажмите «Сканировать», затем сфокусируйтесь на изображении и нажмите «Захват», чтобы получить изображения автофлуоресценции в покоящихся нейральных стволовых клетках и активных нейральных стволовых клетках. Убедитесь, что вы собрали изображения в одной плоскости с цитоплазмой клеток в фокусе для репрезентативного поперечного сечения каждой клетки. Начинайте визуализацию с низкой мощности лазера и постепенно увеличивайте мощность до тех пор, пока сигнал автофлуоресценции не станет обнаруживаемым без насыщения.
Анализируйте неподвижные нейральные стволовые клетки и активные нейральные стволовые клетки с помощью проточного цитометра с помощью насадки 130 микрометров. Применяйте оптические условия в соответствии с возможностями прибора и обнаруживайте точечную автофлуоресценцию. Соберите не менее 10 000 синглетных qNSC и aNSC в файле данных.
Используйте эти данные для проектирования вентилей для сбора обогащенной популяции qNSC или aNSCs. Затем отсортируйте синглетные клетки в лунки, покрытые ламинином PLO, заполненные средой aNSC. После FACS дайте нервным стволовым клеткам инкубироваться в течение трех часов.
Чтобы зафиксировать клетки, добавьте 4% параформальдегида, убедившись, что его достаточно покрыть дном посуды и инкубировать. Через 15 минут проникните в клетки 0,25% Тритоном в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого обработайте клетки раствором для окрашивания EdU при комнатной температуре в течение 30 минут.
Далее промойте образцы три раза по 10 минут каждый PBS. Начните с использования окуляров, чтобы найти подходящее поле зрения и отрегулировать путь света к образцу на микроскопе, чтобы обеспечить получение изображений в темноте с помощью многофотона. Настройка для коллекции изображения одного канала.
Перейдите на вкладку усиления мощности и отрегулируйте коэффициент усиления на PMT на 800. Перейдите на вкладку 2P Laser и выберите 750 нанометров для длины волны лазера и убедитесь, что используется правильный куб фильтра. Чтобы собрать изображение первого канала, перейдите на вкладку «Усиление силы» и установите значение Pockels на 30.
Затем перейдите в раздел сканирования на экране и нажмите «Сканирование в реальном времени», чтобы запустить режим предварительного просмотра. Постепенно увеличивайте Pockels для достижения подходящего поля зрения при низкой мощности лазера. После определения подходящего поля зрения отрегулируйте мощность лазера до 3,6 милливатт.
Затем перейдите в раздел сканирования и нажмите кнопку «Одиночное сканирование», чтобы получить изображение в течение 60 секунд. Чтобы получить изображение второго канала, перейдите на вкладку «Лазер 2P» и выберите 890 нанометров для лазера. Замените фильтрующий куб на эмиссионный куб второго канала.
Запустите режим предварительного просмотра. Увеличивайте Pockels до тех пор, пока измеритель мощности не покажет примерно семь милливатт, а значение CFD не составит от 10 000 до 100 000. Нажмите на одно сканирование и сделайте снимок второго канала в течение 60 секунд.
Конфокальная автофлуоресцентная визуализация была использована для дифференциации между покоящимися нейральными стволовыми клетками и активированными нейральными стволовыми клетками. Было обнаружено, что кНСК демонстрируют большее количество PAF, чем аНСК, что свидетельствует об использовании автофлуоресценции в качестве маркера для идентификации состояния клетки. С помощью FACS состояния клеток НСК обогащали на основе автофлуоресценции.
Клетки, отсортированные с высокого автофлуоресцентного затвора, показали более низкую скорость пролиферации по сравнению со смешанным образцом, в то время как клетки с низким аутофлуоресцентным затвором были более пролиферативными, что подтверждает обогащение активационных состояний НСК. Кроме того, FLIM был использован для оценки автофлуоресценции НСК и определения состояния активации НСК. Примечательно, что кНСК показали более высокую среднюю продолжительность жизни флуоресценции в первом канале, но меньшую долю флуоресцентного компонента альфа по сравнению с аНСК.
Модель логистической регрессии, включающая данные из обоих каналов, дала почти идеальную прогностическую способность для состояний активации NSC, на что указывает кривая характеристик оператора приемника, подчеркивающая потенциал FLIM в классификации состояний NSC. После этой процедуры было бы неплохо проверить результаты с использованием других подходов для измерения состояния активации нейральных стволовых клеток.
