Este protocolo fornece uma nova abordagem para classificar o estado de ativação de células-tronco neurais com uma coorte de vantagens técnicas. Usando este protocolo, podemos obter uma análise de resolução de célula única sem marcação de células vivas do estado de ativação de células-tronco neurais. Este protocolo pode ser usado para lançar luz sobre os mecanismos que regulam a neurogênese adulta.
A autofluorescência é muito mais fraca do que muitos pesquisadores de fluoróforos estão acostumados a trabalhar. Tenha certeza de usar potências de laser mais altas para coletar seus dados. Demonstrando o procedimento estará Chris Morrow, um ex-aluno de pós-graduação do meu laboratório.
Comece configurando o microscópio confocal para imagens de autofluorescência. Clique em 405 Laser e digite na janela de emissão no menu 405 laser. Prossiga para clicar em TD para coletar uma imagem de luz transmitida e defina o valor HV para visualizar a amostra.
Ajuste a potência do laser para 3.5% e defina o ganho para 75. Defina o zoom para dois. Para os parâmetros de varredura confocal, defina a permanência de pixel para 0,5 e a resolução para 2048 por 2048 pixels.
Usando lente objetiva de imersão em óleo 60X sob campo claro, coloque as células em foco. Clique em Eye Port para alternar para o modo de varredura confocal. Certifique-se de que o caminho da luz esteja direcionado para o cabeçote de varredura e confirme se nenhum cubo de filtro está obstruindo o caminho da luz.
Clique em Digitalizar, concentre-se na imagem e clique em Capturar para adquirir imagens de autofluorescência em células-tronco neurais quiescentes e células-tronco neurais ativas. Certifique-se de coletar imagens de plano único com o citoplasma das células em foco para uma seção transversal representativa de cada célula. Inicie a geração de imagens com baixa potência do laser e aumente gradualmente a potência até que o sinal de autofluorescência seja detectável sem causar saturação.
Analise células-tronco neurais quiescentes e células-tronco neurais ativas com um citômetro de fluxo usando um bico de 130 micrômetros. Aplique condições ópticas de acordo com as capacidades do instrumento e detecte a autofluorescência pontilhada. Colete pelo menos 10.000 qNSCs e aNSCs singlete em um arquivo de dados.
Utilize esses dados para projetar portas para coletar uma população enriquecida de qNSCs ou aNSCs. Em seguida, classifique as células singlete em poços revestidos de laminina PLO preenchidos com meio aNSC. Após o FACS, permita que as células-tronco neurais incubem por três horas.
Para fixar as células, adicione 4% de paraformaldeído, garantindo que seja suficiente para cobrir o fundo do prato e incubar. Após 15 minutos, permeabilize as células com 0,25% de Triton em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, trate as células com uma solução de coloração EdU em temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, lave as amostras três vezes por 10 minutos cada com PBS. Comece usando as oculares para localizar um campo de visão adequado e ajuste o caminho da luz para a amostra no microscópio para permitir a imagem no escuro com o multifóton. Configure para a coleta de imagens do canal um.
Navegue até a guia de ganho de potência e ajuste o ganho no PMT para 800. Clique na guia Laser 2P e selecione 750 nanômetros para o comprimento de onda do laser e certifique-se de que o cubo de filtro correto seja usado. Para coletar a imagem do canal um, clique na guia Ganho de potência e defina os Pockels como 30.
Em seguida, prossiga para a seção de digitalização da tela e clique em Live Scan para iniciar o modo de visualização. Aumente gradualmente os Pockels para obter um campo de visão adequado com baixa potência do laser. Uma vez identificado um campo de visão adequado, ajuste a potência do laser para 3.6 miliwatts.
Em seguida, prossiga para a seção de digitalização e clique em varredura única para capturar uma imagem do canal um em 60 segundos. Para coletar uma imagem do canal dois, clique na guia Laser 2P e selecione 890 nanômetros para o laser. Substitua o cubo do filtro pelo cubo de emissão do canal dois.
Inicie o modo de visualização. Aumente os Pockels até que o medidor de potência mostre aproximadamente sete miliwatts e as contagens de CFD estejam entre 10.000 e 100.000. Clique em varredura única e capture uma imagem do canal dois durante 60 segundos.
A imagem de autofluorescência confocal foi empregada para diferenciar entre células-tronco neurais quiescentes e células-tronco neurais ativadas. Verificou-se que os qNSCs exibem um número maior de PAF do que os aNSCs, demonstrando o uso da autofluorescência como marcador para identificação do estado celular. Usando FACS, os estados das células NSC foram enriquecidos com base na autofluorescência.
As células classificadas a partir da porta de alta autofluorescência apresentaram uma taxa de proliferação menor em comparação com a amostra mista, enquanto as da porta de baixa autofluorescência foram mais proliferativas, confirmando o enriquecimento dos estados de ativação do NSC. Além disso, o FLIM foi utilizado para avaliar a autofluorescência do NSC e discernir o estado de ativação dos NSCs. Notavelmente, os qNSCs mostraram um tempo médio de vida mais alto de fluorescência no canal um, mas uma proporção menor do componente de fluorescência alfa um em comparação com os aNSCs.
Um modelo de regressão logística incorporando dados de ambos os canais produziu uma capacidade preditiva quase perfeita para os estados de ativação do NSC, conforme indicado por uma curva característica do operador receptor ressaltando o potencial do FLIM na classificação dos estados do NSC. Seguindo este procedimento, seria bom validar os resultados usando outras abordagens para medir o estado de ativação das células-tronco neurais.
