Este protocolo proporciona un nuevo enfoque para clasificar el estado de activación de las células madre neurales con una cohorte de ventajas técnicas. Con este protocolo, podemos lograr un análisis de resolución de célula única sin marcadores de células vivas del estado de activación de las células madre neurales. Este protocolo se puede utilizar para arrojar luz sobre los mecanismos que regulan la neurogénesis adulta.
La autofluorescencia es mucho más tenue que muchos fluoróforos con los que los investigadores están acostumbrados a trabajar. Tenga la confianza de utilizar potencias láser más altas para recopilar sus datos. El demostrador del procedimiento estará a cargo de Chris Morrow, un antiguo estudiante graduado de mi laboratorio.
Comience por configurar el microscopio confocal para la obtención de imágenes de autofluorescencia. Haga clic en Láser 405 y escriba en la ventana de emisión debajo del menú Láser 405. Proceda a hacer clic en TD para recopilar una imagen de luz transmitida y establezca el valor HV para visualizar la muestra.
Ajuste la potencia del láser a 3.5% y establezca la ganancia en 75. Establezca el zoom en dos. Para los parámetros de escaneo confocal, establezca la permanencia de píxeles en 0,5 y la resolución en 2048 por 2048 píxeles.
Usando una lente de objetivo de inmersión en aceite de 60X en campo claro, enfoque las celdas. Haga clic en Eye Port para cambiar al modo de escaneo confocal. Asegúrese de que la trayectoria de la luz esté dirigida hacia el cabezal de escaneo y confirme que ningún cubo de filtro esté obstruyendo la trayectoria de la luz.
Haga clic en Escanear, luego concéntrese en la imagen y haga clic en Capturar para adquirir imágenes de autofluorescencia en células madre neurales inactivas y células madre neurales activas. Asegúrese de recopilar imágenes de un solo plano con el citoplasma de las células enfocado para una sección transversal representativa de cada célula. Comience a obtener imágenes con potencias láser bajas y aumente gradualmente la potencia hasta que la señal de autofluorescencia sea detectable sin causar saturación.
Analice las células madre neurales inactivas y las células madre neurales activas con un citómetro de flujo utilizando una boquilla de 130 micrómetros. Aplique las condiciones ópticas según las capacidades del instrumento y detecte la autofluorescencia punteada. Recopile al menos 10.000 qNSC y aNSC singletes en un archivo de datos.
Utilice estos datos para diseñar puertas para recopilar una población enriquecida de qNSC o aNSC. A continuación, clasifique las células singlete en pocillos recubiertos de laminina PLO llenos de medio aNSC. Después de FACS, permita que las células madre neurales se incuben durante tres horas.
Para fijar las celdas, agregue un 4% de paraformaldehído, asegurándose de que sea suficiente para cubrir el fondo del plato e incubar. Después de 15 minutos, permeabilice las células con 0.25%Triton en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, trate las células con una solución de tinción de EdU a temperatura ambiente durante 30 minutos.
A continuación, lave las muestras tres veces durante 10 minutos cada una con PBS. Comience por usar los oculares para ubicar un campo de visión adecuado y ajustar la trayectoria de la luz a la muestra en el microscopio para permitir la obtención de imágenes en la oscuridad con el multifotón. Configuración para la colección de imágenes del canal uno.
Navegue hasta la pestaña de ganancia de potencia y ajuste la ganancia en el PMT a 800. Haga clic en la pestaña Láser 2P y seleccione 750 nanómetros para la longitud de onda del láser y asegúrese de que se utilice el cubo de filtro correcto. Para capturar la imagen del canal uno, haga clic en la pestaña Ganancia de energía y establezca los Pockels en 30.
Luego proceda a la sección de escaneo de la pantalla y haga clic en Live Scan para iniciar el modo de vista previa. Aumente gradualmente los Pockels para lograr un campo de visión adecuado a baja potencia láser. Una vez que se haya identificado un campo de visión adecuado, ajuste la potencia del láser a 3,6 milivatios.
A continuación, vaya a la sección de escaneo y haga clic en escaneo único para capturar una imagen de un canal durante 60 segundos. Para capturar una imagen del canal dos, haga clic en la pestaña Láser 2P y seleccione 890 nanómetros para el láser. Reemplace el cubo de filtro con el cubo de emisión del canal dos.
Inicie el modo de vista previa. Aumente los Pockels hasta que el medidor de potencia muestre aproximadamente siete milivatios y los recuentos de CFD estén entre 10.000 y 100.000. Haga clic en escaneo único y capture una imagen de canal dos durante 60 segundos.
Se emplearon imágenes de autofluorescencia confocal para diferenciar entre células madre neurales inactivas y células madre neurales activadas. Se encontró que las qNSCs muestran un mayor número de PAF que las aNSCs, lo que demuestra el uso de la autofluorescencia como marcador para la identificación del estado celular. Usando FACS, los estados de las células NSC se enriquecieron en base a la autofluorescencia.
Las células seleccionadas de la puerta de alta autofluorescencia mostraron una menor tasa de proliferación en comparación con la muestra mezclada, mientras que las de la puerta de baja autofluorescencia fueron más proliferativas, lo que confirma el enriquecimiento de los estados de activación de NSC. Además, se utilizó FLIM para evaluar la autofluorescencia de las NSC y discernir el estado de activación de las NSC. En particular, las qNSC mostraron una mayor vida media de fluorescencia en el canal uno, pero una menor proporción del componente de fluorescencia alfa uno en comparación con las aNSC.
Un modelo de regresión logística que incorporó datos de ambos canales arrojó una capacidad predictiva casi perfecta para los estados de activación del NSC, como lo indica una curva característica del operador del receptor, lo que subraya el potencial de FLIM en la clasificación de los estados del NSC. Siguiendo este procedimiento, sería bueno validar los resultados utilizando otros enfoques para medir el estado de activación de las células madre neurales.
