このプロトコルは、神経幹細胞の活性化状態を技術的な利点のコホートで分類するための新しいアプローチを提供します。このプロトコルを使用すると、神経幹細胞の活性化状態の生細胞ラベルフリーのシングルセル分解能解析を実現できます。このプロトコルは、成体の神経新生を調節するメカニズムに光を当てるために使用できます。
自家蛍光は、研究者が慣れ親しんでいる多くの蛍光色素よりもはるかに暗いです。より高いレーザー出力を使用してデータを収集することに自信を持つことができます。その手順を実演するのは、私の研究室の元大学院生であるクリス・モローです。
まず、共焦点顕微鏡を自家蛍光イメージング用に構成します。[405 Laser] をクリックし、[405 Laser] メニューの下の [Emission Window] に入力します。TDをクリックして透過光画像を収集し、HV値を設定してサンプルを視覚化します。
レーザー出力を3.5%に調整し、ゲインを75に設定します。ズームを 2 に設定します。共焦点スキャンパラメータでは、ピクセルドウェルを0.5に、解像度を2048 x 2048ピクセルに設定します。
明視野下で60倍油浸対物レンズを使用して、細胞に焦点を合わせます。「アイポート」をクリックして、共焦点スキャンモードに切り替えます。光路がスキャンヘッドに向けられていることを確認し、フィルターキューブが光路を遮っていないことを確認します。
「スキャン」をクリックし、画像にピントを合わせて「キャプチャ」をクリックすると、静止神経幹細胞および活動性神経幹細胞の自家蛍光の画像を取得できます。各細胞の代表的な断面について、焦点を合わせた細胞の細胞質で単一平面画像を確実に収集してください。低レーザー出力でイメージングを開始し、飽和を引き起こさずに自家蛍光信号が検出可能になるまで、出力を徐々に増やします。
静止性神経幹細胞と活動性神経幹細胞をフローサイトメーターで130μmノズルで解析します。装置の能力に応じて光学条件を適用し、点状の自家蛍光を検出します。データファイルに少なくとも 10, 000 個のシングレット qNSC と aNSC を収集します。
このデータを利用して、qNSCまたはaNSCの濃縮された母集団を収集するためのゲートを設計します。次に、一重項細胞をaNSC培地で満たされたPLOラミニン被覆ウェルに選別します。FACS後、神経幹細胞を3時間インキュベートします。
細胞を固定するには、4%パラホルムアルデヒドを添加し、皿の底を覆ってインキュベートするのに十分であることを確認します。15分後、0.25%トリトン含有PBSで細胞を室温で15分間透過処理します。その後、細胞をEdU染色溶液で室温で30分間処理します。
次に、サンプルをPBSでそれぞれ10分間、3回洗浄します。まず、接眼レンズを使用して適切な視野を確保し、顕微鏡上のサンプルへの光路を調整して、多光子による暗闇でのイメージングを可能にします。チャンネル 1 の画像のコレクション用に設定します。
[Power Gain] タブに移動し、PMT のゲインを 800 に調整します。[2Pレーザー]タブをクリックし、レーザー波長に750ナノメートルを選択し、正しいフィルターキューブが使用されていることを確認します。チャンネル 1 の画像を収集するには、[Power Gain] タブをクリックし、[Pockels] を 30 に設定します。
次に、画面のスキャンセクションに進み、[ライブスキャン]をクリックしてプレビューモードを開始します。ポッケルスを段階的に増やして、低レーザー出力で適切な視野を実現します。適切なフィールドが特定されたら view、レーザー出力を3.6ミリワットに調整します。
次に、スキャンセクションに進み、シングルスキャンをクリックして、60秒にわたってチャネル1つの画像をキャプチャします。チャンネル2の画像を収集するには、[2Pレーザー]タブをクリックし、レーザーに890ナノメートルを選択します。フィルターキューブをチャネル2の発光キューブに置き換えます。
プレビュー モードを開始します。パワーメーターが約7ミリワットを表示し、CFDカウントが10, 000から100, 000の間になるまで、ポッケルスを増やします。シングルスキャンをクリックし、60秒間にわたってチャンネル2の画像をキャプチャします。
共焦点自家蛍光イメージングを使用して、静止神経幹細胞と活性化神経幹細胞を区別しました。その結果、qNSCはaNSCよりもPAFの数が多いことがわかり、細胞状態同定のマーカーとして自家蛍光を使用することが実証されました。FACSを用いて、NSC細胞の状態を自家蛍光に基づいて濃縮しました。
高自家蛍光ゲートから選別された細胞は、混合サンプルと比較して増殖速度が低かったのに対し、低自家蛍光ゲートから選別された細胞はより増殖性が高く、NSC活性化状態の濃縮が確認されました。さらに、FLIMは、NSCの自家蛍光を評価し、NSCの活性化状態を識別するために利用されました。特に、qNSCは、チャネル1での平均蛍光寿命が長いことを示しましたが、蛍光成分のα1の割合はaNSCと比較して低くなりました。
両方のチャネルからのデータを組み込んだロジスティック回帰モデルにより、NSCの活性化状態についてほぼ完璧な予測能力が得られ、受信者のオペレーター特性曲線によって示され、NSC状態の分類におけるFLIMの可能性が強調されました。この手順に続いて、神経幹細胞の活性化状態を測定するための他のアプローチを使用して結果を検証するとよいでしょう。
