Questo protocollo fornisce un nuovo approccio per classificare lo stato di attivazione delle cellule staminali neurali con una coorte di vantaggi tecnici. Utilizzando questo protocollo, possiamo ottenere un'analisi della risoluzione di singole cellule vive e senza marcatura dello stato di attivazione delle cellule staminali neurali. Questo protocollo può essere utilizzato per far luce sui meccanismi che regolano la neurogenesi adulta.
L'autofluorescenza è molto più debole di quella di molti fluorofori con cui i ricercatori sono abituati a lavorare. Sii sicuro nell'uso di potenze laser più elevate per raccogliere i tuoi dati. A dimostrare la procedura sarà Chris Morrow, un ex studente laureato del mio laboratorio.
Iniziare configurando il microscopio confocale per l'imaging in autofluorescenza. Fare clic su 405 Laser e digitare nella finestra di emissione nel menu 405 laser. Procedere con il clic su TD per raccogliere un'immagine a luce trasmessa e impostare il valore HV per visualizzare il campione.
Regolare la potenza del laser al 3,5% e impostare il guadagno su 75. Impostare lo zoom su due. Per i parametri di scansione confocale, impostare la permanenza dei pixel su 0,5 e la risoluzione su 2048 per 2048 pixel.
Utilizzando l'obiettivo a immersione in olio 60X in campo chiaro, mettere a fuoco le cellule. Fare clic su Eye Port per passare alla modalità di scansione confocale. Assicurarsi che il percorso della luce sia diretto verso la testina di scansione e verificare che nessun cubo del filtro ostruisca il percorso della luce.
Fare clic su Scansione, quindi mettere a fuoco l'immagine e fare clic su Acquisisci per acquisire immagini dell'autofluorescenza nelle cellule staminali neurali quiescenti e nelle cellule staminali neurali attive. Assicurarsi di raccogliere immagini su un singolo piano con il citoplasma delle cellule a fuoco per una sezione trasversale rappresentativa di ciascuna cellula. Iniziare l'imaging con basse potenze laser e aumentare gradualmente la potenza fino a quando il segnale di autofluorescenza non è rilevabile senza causare saturazione.
Analizza le cellule staminali neurali quiescenti e le cellule staminali neurali attive con un citometro a flusso utilizzando un ugello da 130 micrometri. Applica le condizioni ottiche secondo le capacità dello strumento e rileva l'autofluorescenza puntata. Raccogliere almeno 10.000 qNSC e aNSC singoletto in un file di dati.
Utilizza questi dati per progettare porte per la raccolta di una popolazione arricchita di qNSC o aNSC. Quindi smistare le cellule singoletto in pozzetti rivestiti di laminina dell'OLP riempiti con terreno aNSC. Dopo il FACS, lasciare che le cellule staminali neurali incubino per tre ore.
Per fissare le cellule, aggiungere il 4% di paraformaldeide, assicurandosi che sia sufficiente coprire il fondo della capsula e incubare. Dopo 15 minuti, permeabilizzare le cellule con Tritone allo 0,25% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trattare le cellule con una soluzione colorante EdU a temperatura ambiente per 30 minuti.
Quindi, lavare i campioni tre volte per 10 minuti ciascuno con PBS. Iniziare utilizzando gli oculari per individuare un campo visivo adeguato e regolare il percorso della luce verso il campione sul microscopio per consentire l'imaging al buio con il multifotone. Impostazione per la raccolta dell'immagine del canale uno.
Passare alla scheda del guadagno di potenza e regolare il guadagno sul PMT su 800. Fare clic sulla scheda Laser 2P e selezionare 750 nanometri per la lunghezza d'onda del laser e assicurarsi che venga utilizzato il cubo del filtro corretto. Per raccogliere l'immagine del canale uno, fare clic sulla scheda Guadagno di potenza e impostare i Pockels su 30.
Quindi procedi alla sezione di scansione dello schermo e fai clic su Live Scan per avviare la modalità di anteprima. Aumenta in modo incrementale i Pockels per ottenere un campo visivo adeguato a bassa potenza laser. Una volta identificato un campo visivo adatto, regolare la potenza del laser a 3,6 milliwatt.
Quindi procedere alla sezione di scansione e fare clic su scansione singola per acquisire un'immagine del canale uno in 60 secondi. Per raccogliere un'immagine del canale due, fare clic sulla scheda Laser 2P e selezionare 890 nanometri per il laser. Sostituire il cubo del filtro con il cubo di emissione del canale due.
Avvia la modalità di anteprima. Aumenta i Pockels fino a quando il misuratore di potenza mostra circa sette milliwatt e i conteggi CFD sono compresi tra 10.000 e 100.000. Fare clic su scansione singola e acquisire un'immagine del canale due per una durata di 60 secondi.
L'imaging confocale in autofluorescenza è stato impiegato per differenziare tra cellule staminali neurali quiescenti e cellule staminali neurali attivate. È stato riscontrato che le qNSC mostrano un numero maggiore di PAF rispetto alle aNSC, dimostrando l'uso dell'autofluorescenza come marcatore per l'identificazione dello stato cellulare. Utilizzando il FACS, gli stati cellulari delle NSC sono stati arricchiti in base all'autofluorescenza.
Le cellule selezionate dall'alto cancello di autofluorescenza hanno mostrato un tasso di proliferazione inferiore rispetto al campione misto, mentre quelle dal basso cancello di autofluorescenza erano più proliferative, confermando l'arricchimento degli stati di attivazione delle NSC. Inoltre, FLIM è stato utilizzato per valutare l'autofluorescenza delle NSC e discernere lo stato di attivazione delle NSC. In particolare, le qNSC hanno mostrato un tempo medio di fluorescenza più elevato nel canale uno, ma una percentuale inferiore del componente alfa della fluorescenza rispetto alle aNSC.
Un modello di regressione logistica che incorpora i dati provenienti da entrambi i canali ha prodotto una capacità predittiva quasi perfetta per gli stati di attivazione delle NSC, come indicato da una curva caratteristica dell'operatore ricevente che sottolinea il potenziale di FLIM nella classificazione degli stati NSC. Seguendo questa procedura, sarebbe bene convalidare i risultati utilizzando altri approcci per misurare lo stato di attivazione delle cellule staminali neurali.
