Ce protocole fournit une nouvelle approche pour classer l’état d’activation des cellules souches neurales avec une cohorte d’avantages techniques. En utilisant ce protocole, nous pouvons réaliser une analyse de résolution de cellule unique sans marquage de cellules vivantes de l’état d’activation des cellules souches neurales. Ce protocole peut être utilisé pour faire la lumière sur les mécanismes régulant la neurogenèse adulte.
L’autofluorescence est beaucoup plus faible que celle de nombreux fluorophores avec lesquels les chercheurs ont l’habitude de travailler. Soyez confiant dans l’utilisation de puissances laser plus élevées pour collecter vos données. Chris Morrow, un ancien étudiant diplômé de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Commencez par configurer le microscope confocal pour l’imagerie par autofluorescence. Cliquez sur Laser 405 et tapez dans la fenêtre d’émission sous le menu Laser 405. Cliquez sur TD pour collecter une image en lumière transmise et réglez la valeur HV pour visualiser l’échantillon.
Réglez la puissance du laser à 3,5 % et réglez le gain sur 75. Réglez le zoom sur deux. Pour les paramètres de balayage confocal, réglez la durée d’attente des pixels sur 0,5 et la résolution sur 2048 par 2048 pixels.
À l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 60X sous fond clair, faites la mise au point sur les cellules. Cliquez sur Eye Port pour passer en mode de balayage confocal. Assurez-vous que le chemin de la lumière est dirigé vers la tête de balayage et vérifiez qu’aucun cube de filtre n’obstrue le chemin de la lumière.
Cliquez sur Scanner, puis concentrez-vous sur l’image, puis cliquez sur Capturer pour acquérir des images d’autofluorescence dans les cellules souches neurales quiescentes et les cellules souches neurales actives. Assurez-vous de collecter des images à plan unique avec le cytoplasme des cellules au point pour une coupe efficace représentative de chaque cellule. Commencez à imager avec de faibles puissances laser et augmentez progressivement la puissance jusqu’à ce que le signal d’autofluorescence soit détectable sans provoquer de saturation.
Analysez les cellules souches neurales quiescentes et les cellules souches neurales actives à l’aide d’un cytomètre en flux à l’aide d’une buse de 130 micromètres. Appliquez des conditions optiques selon les capacités de l’instrument et détectez l’autofluorescence ponctuée. Collectez au moins 10 000 qNSC et aNSC singulet dans un fichier de données.
Utilisez ces données pour concevoir des portes de collecte d’une population enrichie de qNSC ou d’aNSC. Ensuite, triez les cellules singulet dans des puits recouverts de laminine PLO remplis d’un milieu aNSC. Après FACS, laissez les cellules souches neurales incuber pendant trois heures.
Pour fixer les cellules, ajoutez 4 % de paraformaldéhyde, en veillant à ce qu’il soit suffisant pour couvrir le fond de la boîte et incuber. Après 15 minutes, perméabilisez les cellules avec 0,25% de Triton dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, traitez les cellules avec une solution de coloration EdU à température ambiante pendant 30 minutes.
Ensuite, lavez les échantillons trois fois pendant 10 minutes chacun avec du PBS. Commencez par utiliser les oculaires pour localiser un champ de vision approprié et ajustez le chemin de la lumière vers l’échantillon sur le microscope pour permettre l’imagerie dans l’obscurité avec le multiphoton. Configuration pour la collecte de l’image du premier canal.
Accédez à l’onglet Gain de puissance et réglez le gain sur le PMT sur 800. Cliquez sur l’onglet Laser 2P et sélectionnez 750 nanomètres pour la longueur d’onde laser et assurez-vous que le bon cube de filtre est utilisé. Pour collecter l’image du canal un, cliquez sur l’onglet Gain de puissance et réglez les Pockels sur 30.
Passez ensuite à la section de balayage de l’écran et cliquez sur Analyse en direct pour démarrer le mode de prévisualisation. Augmentez progressivement les Pockels pour obtenir un champ de vision approprié à faible puissance laser. Une fois qu’un champ de vision approprié a été identifié, ajustez la puissance du laser à 3,6 milliwatts.
Passez ensuite à la section de balayage et cliquez sur balayage unique pour capturer une image de canal un sur 60 secondes. Pour collecter une image de canal deux, cliquez sur l’onglet Laser 2P et sélectionnez 890 nanomètres pour le laser. Remplacez le cube de filtre par le cube d’émission du canal deux.
Lancez le mode de prévisualisation. Augmentez les Pockels jusqu’à ce que le capteur de puissance indique environ sept milliwatts et que le nombre de CFD soit compris entre 10 000 et 100 000. Cliquez sur un seul balayage et capturez une image de canal deux sur une durée de 60 secondes.
L’imagerie confocale par autofluorescence a été utilisée pour différencier les cellules souches neurales quiescentes des cellules souches neurales activées. Il a été constaté que les qNSC présentent un nombre plus élevé de PAF que les aNSC, démontrant l’utilisation de l’autofluorescence comme marqueur pour l’identification de l’état cellulaire. À l’aide de FACS, les états des cellules NSC ont été enrichis en fonction de l’autofluorescence.
Les cellules triées à partir de la porte à autofluorescence élevée ont montré un taux de prolifération plus faible par rapport à l’échantillon mixte, tandis que celles provenant de la porte à faible autofluorescence étaient plus prolifératives, confirmant l’enrichissement des états d’activation des NSC. De plus, FLIM a été utilisé pour évaluer l’autofluorescence des NSC et discerner l’état d’activation des NSC. Notamment, les qNSC ont montré une durée de vie moyenne de fluorescence plus élevée dans le canal un, mais une proportion plus faible du composant de fluorescence alpha un par rapport aux aNSC.
Un modèle de régression logistique intégrant les données des deux canaux a produit une capacité prédictive presque parfaite pour les états d’activation des NSC, comme l’indique une courbe caractéristique de l’opérateur récepteur soulignant le potentiel de FLIM dans la classification des états NSC. Après cette procédure, il serait bon de valider les résultats en utilisant d’autres approches pour mesurer l’état d’activation des cellules souches neurales.
