Dieses Protokoll bietet einen neuen Ansatz zur Klassifizierung des Aktivierungszustands von neuralen Stammzellen mit einer Kohorte von technischen Vorteilen. Mit diesem Protokoll können wir eine Analyse des Aktivierungszustands von neuralen Stammzellen ohne Markierung von Einzelzellen durchführen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Licht in die Mechanismen zu bringen, die die adulte Neurogenese regulieren.
Die Autofluoreszenz ist viel schwächer als bei vielen Fluorophoren, mit denen Forscher zu arbeiten gewohnt sind. Seien Sie zuversichtlich, höhere Laserleistungen zur Erfassung Ihrer Daten zu verwenden. Das Verfahren wird von Chris Morrow, einem ehemaligen Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt.
Beginnen Sie mit der Konfiguration des konfokalen Mikroskops für die Autofluoreszenzbildgebung. Klicken Sie auf 405 Laser und geben Sie den Text in das Emissionsfenster unter dem 405-Lasermenü ein. Klicken Sie auf TD, um ein Durchlichtbild aufzunehmen, und stellen Sie den HV-Wert ein, um die Probe zu visualisieren.
Stellen Sie die Laserleistung auf 3,5 % ein und stellen Sie die Verstärkung auf 75 ein. Stellen Sie den Zoom auf zwei ein. Legen Sie für die konfokalen Scanparameter die Pixelverweildauer auf 0,5 und die Auflösung auf 2048 x 2048 Pixel fest.
Bringen Sie die Zellen mit einer 60-fachen Ölimmersionsobjektivlinse unter Hellfeld in den Fokus. Klicken Sie auf Eye Port, um in den konfokalen Scanmodus zu wechseln. Stellen Sie sicher, dass der Strahlengang auf den Scankopf gerichtet ist, und vergewissern Sie sich, dass kein Filterwürfel den Strahlengang behindert.
Klicken Sie auf Scannen, fokussieren Sie sich auf das Bild und klicken Sie auf Erfassen, um Bilder der Autofluoreszenz in ruhenden neuralen Stammzellen und aktiven neuralen Stammzellen aufzunehmen. Stellen Sie sicher, dass Einzelebenenbilder mit dem Zytoplasma der Zellen im Fokus aufgenommen werden, um einen repräsentativen Querschnitt jeder Zelle zu erhalten. Beginnen Sie mit der Bildgebung mit geringer Laserleistung und erhöhen Sie die Leistung schrittweise, bis das Autofluoreszenzsignal nachweisbar ist, ohne eine Sättigung zu verursachen.
Analysieren Sie ruhende neurale Stammzellen und aktive neurale Stammzellen mit einem Durchflusszytometer unter Verwendung einer 130-Mikrometer-Düse. Wenden Sie optische Bedingungen an, die den Fähigkeiten des Instruments entsprechen, und erkennen Sie punktuelle Autofluoreszenz. Sammeln Sie mindestens 10.000 Singulett-qNSCs und aNSCs in einer Datendatei.
Nutzen Sie diese Daten, um Gates für die Erfassung einer angereicherten Population von qNSCs oder aNSCs zu entwerfen. Sortieren Sie dann die Singulett-Zellen in PLO-Laminin-beschichtete Vertiefungen, die mit aNSC-Medium gefüllt sind. Lassen Sie die neuralen Stammzellen nach dem FACS drei Stunden lang inkubieren.
Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie 4% Paraformaldehyd hinzu und stellen Sie sicher, dass es ausreicht, den Boden der Schale zu bedecken und zu inkubieren. Nach 15 Minuten permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,25% Triton in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend werden die Zellen 30 Minuten lang mit einer EdU-Färbelösung bei Raumtemperatur behandelt.
Waschen Sie die Proben anschließend dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBS. Beginnen Sie damit, mit dem Okular ein geeignetes Sichtfeld zu lokalisieren, und passen Sie den Lichtweg zur Probe am Mikroskop an, um eine Bildgebung im Dunkeln mit dem Multiphoton zu ermöglichen. Richten Sie sich für die Sammlung von Bildern aus Kanal eins ein.
Navigieren Sie zur Registerkarte Power Gain und stellen Sie die Verstärkung am PMT auf 800 ein. Klicken Sie auf die Registerkarte 2P-Laser und wählen Sie 750 Nanometer für die Laserwellenlänge aus und stellen Sie sicher, dass der richtige Filterwürfel verwendet wird. Um ein Bild für den ersten Kanal aufzunehmen, klicken Sie auf die Registerkarte Power Gain und stellen Sie Pockels auf 30 ein.
Fahren Sie dann mit dem Scanbereich des Bildschirms fort und klicken Sie auf Live-Scan, um den Vorschaumodus zu starten. Erhöhen Sie die Pockels schrittweise, um ein geeignetes Sichtfeld bei geringer Laserleistung zu erreichen. Sobald ein geeignetes Sichtfeld identifiziert wurde, stellen Sie die Laserleistung auf 3,6 Milliwatt ein.
Fahren Sie dann mit dem Scanbereich fort und klicken Sie auf Einzelscan, um ein Kanal-Eins-Bild über einen Zeitraum von 60 Sekunden aufzunehmen. Um ein Bild von Kanal zwei aufzunehmen, klicken Sie auf die Registerkarte 2P-Laser und wählen Sie 890 Nanometer für den Laser aus. Ersetzen Sie den Filterwürfel durch den Emissionswürfel für Kanal zwei.
Starten Sie den Vorschaumodus. Erhöhen Sie den Pockels-Wert, bis der Leistungsmesser etwa sieben Milliwatt anzeigt und die CFD-Zählungen zwischen 10.000 und 100.000 liegen. Klicken Sie auf Einzelscan und nehmen Sie ein Bild von Kanal zwei über eine Dauer von 60 Sekunden auf.
Die konfokale Autofluoreszenzbildgebung wurde eingesetzt, um zwischen ruhenden neuralen Stammzellen und aktivierten neuralen Stammzellen zu unterscheiden. Es wurde festgestellt, dass qNSCs eine höhere Anzahl von PAF aufweisen als aNSCs, was die Verwendung von Autofluoreszenz als Marker für die Identifizierung von Zellzuständen zeigt. Mit Hilfe von FACS wurden die NSC-Zellzustände auf Basis von Autofluoreszenz angereichert.
Zellen, die aus dem hohen Autofluoreszenz-Gate sortiert wurden, zeigten eine niedrigere Proliferationsrate im Vergleich zur gemischten Probe, während diejenigen aus dem niedrigen Autofluoreszenz-Gate proliferativer waren, was die Anreicherung der NSC-Aktivierungszustände bestätigt. Darüber hinaus wurde FLIM verwendet, um die Autofluoreszenz von NSCs zu beurteilen und den Aktivierungszustand von NSCs zu bestimmen. Bemerkenswert ist, dass qNSCs eine höhere mittlere Lebensdauer der Fluoreszenz im ersten Kanal aufwiesen, aber einen geringeren Anteil der Fluoreszenzkomponente alpha eins im Vergleich zu aNSCs.
Ein logistisches Regressionsmodell, das Daten aus beiden Kanälen umfasste, ergab eine nahezu perfekte Vorhersagefähigkeit für NSC-Aktivierungszustände, wie eine Empfänger-Operator-Kennlinie zeigt, die das Potenzial von FLIM bei der Klassifizierung von NSC-Zuständen unterstreicht. Nach diesem Verfahren wäre es gut, die Ergebnisse mit anderen Ansätzen zur Messung des Aktivierungszustands neuraler Stammzellen zu validieren.
