يحدد هذا البروتوكول طريقة لزراعة وتمرير مجموعة مهمة من الخلايا في الرئة ويؤسس منصة ذات صلة فسيولوجيا للتعرض البيئي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها للتحقيق في بيولوجيا الرئة في سياق التوازن والمرض. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى ثاقبة ، خاصة في الأمراض الرئوية التي تؤثر على الحويصلات الهوائية الرئوية ، بما في ذلك تلك التي تسببها المتغيرات الجينية أو التعرض البيئي أو العوامل المعدية أو مزيج من هذه العوامل.
سيكون عرض الإجراء هو وريانون فيردر ، بمساعدة كريستي أبو ، دكتوراه في الطب ، طالبة دكتوراه ، وأوليفيا هيكس ، مديرة مختبر من مختبراتنا. أولا ، قم بشفط كل وسيط CK DCI من قطرات مصفوفة 3D التي تحتوي على المستكشفات الأسناخية المشتقة من التمايز الموجه في لوحة 12 بئرا. أضف ملليلتر واحد من dispase لكل قطرة.
قم بماصة القطيرة بلطف في الديسباس باستخدام ماصة P-1000. بعد الحضانة ، تنقل المواد العضوية المنفصلة من قطرة مصفوفة واحدة في التباعد إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. أضف 10 ملليلتر من Dulbecco's Mod Medium من Iscove وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
شفط supernatant قدر الإمكان. أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من 0.05٪ من التربسين لكل قطرة وانقلها مرة أخرى إلى لوحة 12 بئرا. احتضن هذا عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 15 دقيقة قبل مراقبة الانفصال تحت المجهر وتجنب الإفراط في سحب الخلايا.
في نهاية الحضانة يتم الحصول على تعليق خلية واحدة. توقف عن عمل التربسين بحجم متساو من مصل البقر الجنيني الذي يحتوي على وسط ، يليه جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة خمس دقائق. اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من IMDM قبل الطرد المركزي التالي.
أعد تعليق الخلايا في وحدة تخزين مناسبة للعد. ثم عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. توليد الأسناخ عن طريق طلاء تعليق خلية واحدة من خلايا iAT2 في مصفوفة 3D أو على إدراج مزرعة الخلايا لثقافة واجهة الهواء والسائل.
بعد حساب الخلايا ، حدد عدد الخلايا المطلوبة لإعادة تشغيلها في مصفوفة 3D وطرد الخلايا مركزيا عند 300 × g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة أكبر قدر ممكن من supernatant باستخدام ماصة وإعادة تعليق الخلايا بسرعة في مصفوفة 3D. قم بتوزيع قطرة مصفوفة ثلاثية الأبعاد واحدة في بئر من لوحة 12 بئرا تم تسخينها مسبقا باستخدام ماصة P-200 دون إنشاء فقاعات في قطرة المصفوفة ، ودون السماح لتعليق الخلية بالاستقرار أثناء توزيع قطرات متعددة.
ضع الصفيحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة للسماح لقطرات المصفوفة بالبلمرة ، ثم أضف ملليلتر واحد من CK DCI 10 micromolar من Y-27632 متوسطة لكل بئر لتغطية قطرة المصفوفة. قم بتغيير الوسط إلى CK DCI بدون 10 ميكرومولير من Y-27632 بعد 72 ساعة واستبدله ب CK DCI طازج كل 48 إلى 72 ساعة. تحضير المغلفة حديثا 6.5 ملم مزرعة الخلايا إدراج قبل ساعة واحدة من الاستخدام عن طريق تخفيف مصفوفة 2D في دولبيكو معدلة النسر المتوسطة / المغذيات خليط F-12 إلى حل العمل.
ثم أضف 100 ميكرولتر من المصفوفة المخففة لكل إدراج 6.5 ملم من ثقافة الخلايا. اسمح للمصفوفة بالبلمرة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو في درجة حرارة الغرفة من ساعة واحدة. استنشاق المصفوفة الزائدة من إدراج مزرعة الخلايا باستخدام ماصة.
اشطفيه باستخدام DMEM F-12 ، واستنشق هذا الغسيل على الفور قبل إضافة الخلايا. الطرد المركزي للخلايا في 300 × غرام لمدة خمس دقائق وإزالة أكبر قدر ممكن من supernatant. أعد تعليق الخلايا في الحجم المناسب للبذور مع 100 ميكرولتر من CK DCI 10 micromolar Y-27632 لكل مزرعة خلية إدراج وإضافة 100 ميكرولتر إلى المقصورة القمية لإدراج مزرعة الخلية.
حرك اللوحة بلطف في نمط متقاطع لضمان التوزيع المتساوي للخلايا ، وتحقق منها تحت المجهر في هدف 10X. أضف 500 ميكرولتر من ميكرومولار CK DCI 10 من Y-27632 إلى المقصورة القاعدية الجانبية لكل إدراج لمزرعة الخلايا ، وبعد 48 ساعة من البذر ، قم بشفط الوسط القمي باستخدام ماصة لبدء واجهة الهواء السائل. بعد 72 ساعة ، قم بتغيير الوسط القاعدي إلى CK DCI بدون 10 ميكرومولار Y-27632 ، متبوعا باستبدال الوسط القاعدي الجانبي ب CK DCI طازج كل 48 إلى 72 ساعة لمدة تصل إلى 28 يوما بعد الطلاء.
تظهر نتائج قياس التدفق الخلوي التمثيلي سهولة التصور لخط SPC2 الذي يحتوي على مراسل tdTomato يستهدف موضع البروتين الخافض للتوتر السطحي الداخلي C وتتبع برنامج الخلايا الظهارية السنخية من النوع 2 بمرور الوقت في الثقافة. تم الحفاظ على تعبير بروتين الفاعل بالسطح للخلايا من النوع 2 المشتق من IPSC عند طلائه في مصفوفة 3D ككرات وعندما تم طلاؤه على إدراج ثقافة الخلية. يمكن قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية لتحديد سلامة ثقافة واجهة الهواء والسائل.
عند محاولة هذا الإجراء تجنب التفكك المفرط إما عن طريق السحب الميكانيكي أو الهضم الأنزيمي لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلية وضعف البقاء على قيد الحياة. الطرق الإضافية التي يتم إجراؤها بعد هذا الإجراء هي قياسات المقاومة الكهربائية عبر الظهارية لسلامة حاجز الفحص ، وإضافة الفيروسات أو المركبات لتحفيز الخلايا ، والتألق المناعي ، والحمض النووي الريبي ، أو البروتين ، أو جمع supernatant. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف بيولوجيا الرئة الجديدة وأسئلة الأمراض ، مثل كيفية تأثير فيروسات مثل SARS COVID-2 أو مركبات مثل أبخرة السجائر الإلكترونية على الظهارة السنخية.
