פרוטוקול זה מתווה שיטה לגידול והעברת אוכלוסיית תאים חשובה בריאה ומקים פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לחשיפה סביבתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לחקור ביולוגיה של הריאות בהקשר של הומאוסטזיס ומחלות. שיטה זו יכולה לספק תובנות, במיוחד לגבי מחלות ריאה המשפיעות על נאדיות ריאה, כולל אלה הנגרמות על ידי וריאנטים גנטיים, חשיפות סביבתיות, גורמים זיהומיים או שילוב של גורמים אלה.
מי שידגימו את ההליך יהיו אני וריינון ורדר, בסיוע קריסטי אבו, MD, דוקטורנטית, ואוליביה היקס, מנהלת מעבדה מהמעבדות שלנו. ראשית, שאפו את כל מדיום ה-CK DCI מטיפות המטריצה התלת-ממדיות המכילות אלוואולוספירה הנגזרת מהתמיינות מכוונת בלוח 12 הבארות. הוסף מיליליטר אחד של dispase לכל טיפה.
מטפטפים בעדינות את הטיפה לתוך הדיספוזה באמצעות פיפטה P-1000. לאחר הדגירה מעבירים את האורגנואידים המנותקים מטיפת מטריצה אחת בדיספוזה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסיפו 10 מיליליטרים של ה-Dulbecco's Modified Dulbecco's Medium של Iscove וצנטריפוגה בגודל 300 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לשאוף את הסופרנטנט ככל האפשר. משחזרים את התאים במיליליטר אחד של 0.05% טריפסין לכל טיפה ומעבירים אותם בחזרה לצלחת של 12 בארות. דגירו את זה ב-37 מעלות צלזיוס במשך 12 עד 15 דקות לפני שתצפו בדיסוציאציה מתחת למיקרוסקופ והימנעו מפיפט יתר של התאים.
בסוף הדגירה מתקבלת השעיה של תא בודד. הפסיקו את הפעולה של טריפסין עם נפח שווה של סרום בקר עוברי המכיל מדיום, ואחריו צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך חמש דקות. לשטוף את התאים עם 10 מיליליטרים של IMDM לפני הצנטריפוגה הבאה.
החייאת התאים בנפח מתאים לספירה. ואז לספור את התאים באמצעות המוציטומטר. צור נאדיות על ידי ציפוי תרחיף של תאים בודדים של תאי iAT2 במטריצה התלת-ממדית או על תוספות תרבית תאים עבור תרבית ממשק אוויר-נוזל.
לאחר ספירת התאים, קבעו את מספר התאים הרצויים להפעלה חוזרת במטריצה התלת-ממדית וצנטריפוגה של התאים ב-300 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר כמה שיותר סופרנטנט באמצעות פיפטה ובצע החייאה מהירה של התאים במטריצה התלת-ממדית. הוציאו טיפת מטריצה תלת-ממדית אחת לתוך באר של לוחית 12-בארות מוכנה מראש באמצעות פיפטה P-200 מבלי ליצור בועות בטיפת המטריצה, ומבלי לאפשר למתלה התא להתיישב תוך כדי חלוקת טיפות מרובות.
מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות כדי לאפשר לטיפות המטריצה להתפלמר, ואז מוסיפים מיליליטר אחד של מיקרומולר CK DCI 10 של מדיום Y-27632 לכל באר כדי לכסות את טיפות המטריצה. שנה את המדיום ל- CK DCI ללא 10 מיקרומולר של Y-27632 לאחר 72 שעות והחלף אותו ב- CK DCI טרי כל 48 עד 72 שעות. הכינו תרבית תאים מצופה טרי של 6.5 מילימטרים שעה לפני השימוש על ידי דילול המטריצה הדו-ממדית בתערובת הנשרים/חומרי הזנה המהונדסים F-12 של Dulbecco לתמיסת העבודה.
לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של המטריצה המדוללת לכל תוספת תרבית תאים של 6.5 מילימטרים. אפשרו למטריצה להתפלמר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או בטמפרטורת החדר משעה אחת. שאפו את המטריצה העודפת מתרבית התאים באמצעות פיפטה.
שטפו אותו עם DMEM F-12, ומיד שאפו לשטוף את הכביסה הזו לפני הוספת התאים. צנטריפוגה על התאים ב 300 x g במשך חמש דקות ולהסיר כמה שיותר supernatant. בצעו החייאה של התאים בנפח המתאים לזרע עם 100 מיקרוליטרים של CK DCI 10 מיקרומולר Y-27632 לכל תוספת תרבית תאים והוסיפו 100 מיקרוליטרים לתא האפיקלי של תוסף תרבית התאים.
התסיסו בעדינות את הצלחת בתבנית צולבת כדי להבטיח התפלגות שווה של תאים, ובדקו אותה תחת מיקרוסקופ בזווית של פי 10. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של CK DCI 10 מיקרומולר של Y-27632 לתא הבזולטרלי של כל תוסף תרבית תאים, ו-48 שעות לאחר הזריעה, שאפו את התווך האפיקלי באמצעות פיפטה כדי ליזום את ממשק האוויר-נוזל. לאחר 72 שעות החליפו את המדיום הבזולטרלי ל-CK DCI ללא 10 מיקרומולר Y-27632, ולאחר מכן החליפו את המדיום הבזולטרלי ב-CK DCI טרי כל 48 עד 72 שעות למשך עד 28 ימים לאחר הציפוי.
תוצאות הציטומטריה של הזרימה הייצוגית מדגימות את קלות ההדמיה של קו SPC2, כאשר כתב tdTomato ממוקד ללוקוס החלבון האנדוגני פעילי שטח C ומעקב אחר תוכנית תאי אפיתל מסוג 2 לאורך זמן בתרבית. ביטוי החלבון פעילי השטח מסוג C tdTomato מסוג 2 של תאים שמקורו ב-IPSC נשמר כאשר הוצב מחדש במטריצה התלת-ממדית ככדורים וכאשר הוא מצופה בתרביות תאים. ניתן למדוד התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית כדי לקבוע את שלמות תרבית ממשק האוויר-נוזל.
כאשר מנסים הליך זה הימנעו מדיסוציאציה מוגזמת על ידי צנרת מכנית או עיכול אנזימטי מכיוון שהדבר עלול להוביל לכדאיות נמוכה של התאים ולהישרדות לקויה. שיטות נוספות המבוצעות לאחר הליך זה הן מדידות של עמידות חשמלית טרנס-פיתלית לבדיקת שלמות מחסום, הוספת וירוסים או תרכובות כדי לעורר את התאים, אימונופלואורסצנציה, ואיסוף RNA, חלבון או סופרנאטנטים. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור ביולוגיה חדשה של הריאות ושאלות על מחלות, כגון כיצד וירוסים כמו SARS COVID-2 או תרכובות כמו אדי סיגריות אלקטרוניות משפיעים על אפיתל הנאדיות.
