このプロトコルは、肺内の重要な細胞集団を培養および継代するための方法を概説し、環境曝露のための生理学的に関連するプラットフォームを確立する。この技術の主な利点は、恒常性と疾患の文脈で肺生物学を調査するために使用できることです。この方法は、特に肺胞に影響を及ぼす肺疾患、遺伝的変異、環境曝露、感染因子、またはこれらの因子の組み合わせによって引き起こされるものを含む、洞察を提供することができる。
手順を実演するのは、私とRhiannon Werderで、医学博士課程の学生であるKristy Aboと、私たちの研究室のラボマネージャーであるOlivia Hixによって支援されます。まず、12ウェルプレートにおける指向性分化に由来する肺胞スフェアを含む3Dマトリックス液滴から全てのCK DCI培地を吸引する。液滴ごとに1ミリリットルのディスパーゼを加える。
液滴をP−1000ピペットを用いてディスパーゼに穏やかにピペットする。インキュベーション後、解離したオルガノイドをディスパーゼ内の1つのマトリックス液滴から15ミリリットルの円錐管に移す。10ミリリットルのIscoveの改質ダルベッコの培地を加え、室温で5分間300 x gで遠心分離機をかけます。
上澄み液をできるだけ吸引する。液滴あたり1ミリリットルの0.05%トリプシンで細胞を再懸濁し、12ウェルプレートに戻します。これを摂氏37度で12〜15分間インキュベートしてから解離を顕微鏡で観察し、細胞のピペッティングを避けてください。
インキュベーションの終わりに、単一細胞懸濁液が得られる。等量のウシ胎児血清含有培地でトリプシンの作用を停止し、続いて300 x gで5分間遠心分離を行った。次の遠心分離の前に、10ミリリットルのIMDMで細胞を洗浄する。
カウントのために適切な体積に細胞を再懸濁する。次いで、血球計数器を用いて細胞を計数した。iAT2細胞の単一細胞懸濁液を3Dマトリックスにプレーティングするか、または気液界面培養用の細胞培養インサート上にプレーティングすることによって、肺胞スフェアを生成する。
細胞をカウントした後、3Dマトリックスで再生する所望の細胞の数を決定し、室温で5分間、300 x gで細胞を遠心分離する。ピペットを使用してできるだけ多くの上清を除去し、3Dマトリックス中の細胞を迅速に再懸濁する。P-200ピペットを使用して、1つの3Dマトリックス液滴を予温した12ウェルプレートのウェルに分配し、マトリックス液滴に気泡を生じさせることなく、また複数の液滴を分配しながら細胞懸濁液を沈降させることなく分配する。
プレートを摂氏37度のインキュベーターに20〜30分間置いてマトリックス液滴を重合させ、次いで1ウェルあたり1ミリリットルのCK DCI 10マイクロモルのY−27632培地を加えてマトリックス液滴を覆う。72時間後に培地を10マイクロモルのY−27632を含まないCK DCIに変更し、48〜72時間ごとに新鮮なCK DCIと交換する。使用の1時間前に、ダルベッコの改変イーグル培地/栄養素混合物F-12で2Dマトリックスを作業溶液に希釈することによって、新しくコーティングされた6.5ミリメートルの細胞培養インサートを準備します。
次いで、6.5ミリメートル細胞培養インサート当たり100マイクロリットルの希釈マトリックスを加える。マトリックスを摂氏37度のインキュベーター内で30分間、または室温で1時間から重合させます。細胞培養インサートから過剰のマトリックスをピペットを用いて吸引する。
DMEM F-12ですすぎ、細胞を加える前に直ちにこの洗浄液を吸引してください。細胞を300 x gで5分間遠心分離し、できるだけ多くの上清を除去します。細胞を適切な体積に再懸濁して、細胞培養インサートあたり10マイクロモルY−27632のCK DCI 10マイクロモルY−27632を播種し、細胞培養インサートの頂端区画に100マイクロリットルを加える。
プレートを十字パターンで穏やかに攪拌して細胞の分布が均一になるようにし、顕微鏡で10倍の対物レンズで確認します。500マイクロリットルのCK DCI 10マイクロモルのY−27632を各細胞培養インサートの側底区画に加え、播種後48時間後に、ピペットを用いて頂端培地を吸引し、気液界面を開始した。72時間後、10マイクロモルY−27632を含まない側底培地をCK DCIに変更し、続いて、めっき後最大28日間、48〜72時間ごとに側底培地を新鮮なCK DCIに交換した。
代表的なフローサイトメトリー結果は、内因性界面活性剤プロテインC遺伝子座を標的とするtdTomatoレポーターを有するSPC2株に対する可視化の容易さ、および培養中の経時的な2型肺胞上皮細胞プログラムの追跡の容易さを実証する。IPSC由来肺胞2型細胞界面活性剤プロテインC tdTomatoの発現は、スフェアとして3Dマトリックス中で再播種した場合、および細胞培養インサート上に播種した場合に維持された。経上皮電気抵抗を測定して、気液界面培養の完全性を決定することができる。
この手順を試みるときは、機械的ピペッティングまたは酵素消化のいずれかによる過度の解離は、細胞生存率の低下および生存率の低下につながる可能性があるため、避けてください。この手順の後に行われるさらなる方法は、アッセイバリア完全性に対する経上皮電気抵抗の測定、細胞を刺激するウイルスまたは化合物の添加、免疫蛍光、およびRNA、タンパク質、または上清収集である。この技術は、SARSのCOVID-2のようなウイルスや電子タバコの蒸気のような化合物が肺胞上皮にどのように影響するかなど、研究者が新しい肺生物学や病気の質問を探求する道を開きました。
