Questo protocollo delinea un metodo per la coltivazione e il passaggio di un'importante popolazione cellulare nel polmone e stabilisce una piattaforma fisiologicamente rilevante per l'esposizione ambientale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per studiare la biologia polmonare nel contesto dell'omeostasi e della malattia. Questo metodo può fornire approfondimenti, in particolare sulle malattie polmonari che colpiscono gli alveoli polmonari, comprese quelle causate da varianti genetiche, esposizioni ambientali, agenti infettivi o una combinazione di questi fattori.
A dimostrare la procedura saremo io e Rhiannon Werder, assistiti da Kristy Abo, md, dottoranda, e Olivia Hix, responsabile di laboratorio dei nostri laboratori. In primo luogo, aspirare tutto il mezzo CK DCI dalle goccioline della matrice 3D contenenti alveolosfere derivate dalla differenziazione diretta nella piastra a 12 pozzetti. Aggiungere un millilitro di dispase per goccia.
Pipettare delicatamente la goccia nella spedizione usando una pipetta P-1000. Dopo l'incubazione trasferire gli organoidi dissociati da una goccia di matrice nella dispasi a un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di Iscove's Modified Dulbecco's Medium e centrifugare a 300 x g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aspirare il surnatante il più possibile. Risospendare le cellule in un millilitro di 0,05% di tripsina per goccia e trasferirlo nuovamente nella piastra a 12 pozzetti. Incubare questo a 37 gradi Celsius per 12-15 minuti prima di osservare la dissociazione al microscopio ed evitare di pipettare eccessivamente le cellule.
Alla fine dell'incubazione si ottiene una sospensione a singola cellula. Interrompere l'azione della tripsina con un volume uguale di siero bovino fetale contenente mezzo, seguito da centrifuga a 300 x g per cinque minuti. Lavare le celle con 10 millilitri di IMDM prima della successiva centrifugazione.
Risospendare le celle in un volume appropriato per il conteggio. E poi contare le cellule usando un emocitometro. Generare alveolosfere placcando la sospensione a singola cellula di cellule iAT2 nella matrice 3D o su inserti di coltura cellulare per la coltura di interfaccia aria-liquido.
Dopo aver contato le cellule, determinare il numero di cellule desiderate da riprodurre nella matrice 3D e centrifugare le celle a 300 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il maggior numero possibile di surnatante utilizzando una pipetta e risospesciare rapidamente le celle nella matrice 3D. Erogare una goccia di matrice 3D in un pozzo di piastra a 12 pozzetti preribalzata utilizzando una pipetta P-200 senza creare bolle nella goccia della matrice e senza consentire alla sospensione cellulare di depositarsi durante l'erogazione di più goccioline.
Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti per consentire alle goccioline della matrice di polimerizzare, quindi aggiungere un millilitro di micromolare CK DCI 10 di Y-27632 medio per pozzetto per coprire la goccia della matrice. Cambiare il mezzo in CK DCI senza 10 micromolari di Y-27632 dopo 72 ore e sostituirlo con CK DCI fresco ogni 48-72 ore. Preparare inserti di coltura cellulare da 6,5 millimetri appena rivestiti un'ora prima dell'uso diluendo la matrice 2D nella miscela F-12 a medio/nutriente Eagle modificata di Dulbecco alla soluzione di lavoro.
Quindi aggiungere 100 microlitri della matrice diluita per inserto di coltura cellulare da 6,5 millimetri. Lasciare polimerizzare la matrice in un incubatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti o a temperatura ambiente da un'ora. Aspirare la matrice in eccesso dagli inserti di coltura cellulare usando una pipetta.
Risciacquare con DMEM F-12 e aspirare immediatamente questo lavaggio prima di aggiungere le cellule. Centrifugare le cellule a 300 x g per cinque minuti e rimuovere il più possibile il surnatante. Risospesciare le cellule nel volume appropriato per seminare con 100 microlitri di CK DCI 10 micromolare Y-27632 per inserto di coltura cellulare e aggiungere 100 microlitri al compartimento apicale dell'inserto di coltura cellulare.
Agitare delicatamente la piastra in uno schema incrociato per garantire la distribuzione uniforme delle cellule e controllarla al microscopio con obiettivo 10X. Aggiungere 500 microlitri di micromolare CK DCI 10 di Y-27632 al compartimento basolaterale di ciascun inserto di coltura cellulare e, 48 ore dopo la semina, aspirare il mezzo apicale utilizzando una pipetta per avviare l'interfaccia aria-liquido. Dopo 72 ore cambiare il mezzo basolaterale in CK DCI senza 10 micromolari Y-27632, seguito dalla sostituzione del mezzo basolaterale con CK DCI fresco ogni 48-72 ore per un massimo di 28 giorni dopo la placcatura.
I risultati rappresentativi della citometria a flusso dimostrano la facilità di visualizzazione per la linea SPC2 con un reporter tdTomato mirato al locus della proteina C tensioattivo endogena e il monitoraggio del programma di cellule epiteliali alveolari di tipo 2 nel tempo in coltura. L'espressione della proteina C tdTomato del tensioattivo alveolare di tipo 2 derivata dall'IPSC è stata mantenuta quando è stata replicata nella matrice 3D come sfere e quando placcata su inserti di coltura cellulare. La resistenza elettrica transepiteliale può essere misurata per determinare l'integrità della coltura di interfaccia aria-liquido.
Quando si tenta questa procedura, evitare un'eccessiva dissociazione mediante pipettaggio meccanico o digestione enzimatica in quanto ciò può portare a una bassa vitalità cellulare e a una scarsa sopravvivenza. Ulteriori metodi eseguiti dopo questa procedura sono le misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale all'integrità della barriera del saggio, l'aggiunta di virus o composti per stimolare le cellule, l'immunofluorescenza e la raccolta di RNA, proteine o surnatante. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare nuove questioni di biologia polmonare e malattia, come il modo in cui virus come la SARS COVID-2 o composti come i vapori di sigaretta elettronica influenzano l'epitelio alveolare.
