该协议概述了一种在肺中培养和传代重要细胞群的方法，并建立了一个与生理相关的环境暴露平台。该技术的主要优点是它可用于在体内平衡和疾病的背景下研究肺部生物学。这种方法可以提供见解，特别是影响肺泡的肺部疾病，包括由遗传变异，环境暴露，感染因子或这些因素的组合引起的疾病。
演示该程序的将是我自己和Rhiannon Werder，由医学博士，博士生Kristy Abo和我们实验室的实验室经理Olivia Hix协助。首先，从含有来自12孔板定向分化的肺泡球的3D基质液滴中吸取所有CK DCI培养基。每滴加入一毫升分散酶。
使用P-1000移液器轻轻地将液滴移入分散酶中。孵育后，将解离的类器官从分散酶中的一个基质液滴转移到15毫升锥形管中。加入10毫升Iscove的改性Dulbecco培养基，并在室温下以300×g离心5分钟。
尽可能多地吸出上清液。将细胞重悬于每滴0.05%胰蛋白酶的一毫升中，并将其转移回12孔板。将其在37摄氏度下孵育12至15分钟，然后在显微镜下观察解离，并避免过度移液细胞。
在孵育结束时，获得单细胞悬浮液。用等体积的含有胎牛血清的培养基停止胰蛋白酶的作用，然后以300×g离心5分钟。在下一次离心之前，用10毫升IMDM洗涤细胞。
将细胞重悬于适当的体积中以进行计数。然后使用血细胞计数器计数细胞。通过在3D基质中或在细胞培养插入物上接种iAT2细胞的单细胞悬浮液来产生肺泡球，以进行空气 - 液体界面培养。
计数细胞后，确定在3D基质中重放的所需细胞数量，并在室温下以300×g离心细胞五分钟。使用移液器去除尽可能多的上清液，并快速将细胞重悬于3D基质中。使用P-200移液器将一个3D基质液滴分配到预热的12孔板孔中，而不会在基质液滴中产生气泡，并且在分配多个液滴时不允许细胞悬浮液沉降。
将板置于37摄氏度的培养箱中20至30分钟，以使基质液滴聚合，然后每孔加入一毫升CK DCI 10微摩尔Y-27632培养基以覆盖基质液滴。72小时后将培养基更换为不含10微摩尔Y-27632的CK DCI，每48至72小时更换一次新鲜的CK DCI。在使用前一小时准备新鲜包被的6.5毫米细胞培养物插入物，方法是将Dulbecco的改良Eagle培养基/营养混合物F-12中的2D基质稀释到工作溶液中。
然后每6.5毫米细胞培养插入物中加入100微升稀释的基质。让基质在37摄氏度的培养箱中聚合30分钟，或在室温下从一小时开始聚合。使用移液器从细胞培养插入物中吸取多余的基质。
用DMEM F-12冲洗，并在加入细胞之前立即吸出该洗涤液。将细胞以300×g离心五分钟，并尽可能多地除去上清液。以适当的体积重悬细胞以每细胞培养插入物用100微升CK DCI 10微摩尔Y-27632接种，并向细胞培养插入物的顶端室中加入100微升。
以交叉模式轻轻搅拌板以确保细胞均匀分布，并在显微镜下以10X物镜检查。向每个细胞培养插入物的基底外侧隔室中加入500微升Y-27632的CK DCI 10微摩尔，并在接种48小时后，使用移液管吸出顶端培养基以启动气液界面。72小时后，将基底外侧培养基更换为CK DCI，没有10微摩尔Y-27632，然后每48至72小时用新鲜的CK DCI替换基底外侧培养基，最长可达接种后28天。
具有代表性的流式细胞术结果表明，SPC2系易于可视化，该细胞系具有靶向内源性表面活性剂蛋白C位点的tdTomato报告基因，并随着时间的推移跟踪2型肺泡上皮细胞的程序。IPSC衍生的肺泡2型细胞表面活性剂蛋白C tdTomato表达在3D基质中作为球体重镀时以及接种在细胞培养插入物上时保持。可以测量跨上皮电阻以确定气液界面培养物的完整性。
当尝试这种手术时，避免通过机械移液或酶消化过度解离，因为这可能导致细胞活力低下和存活率差。在此程序之后执行的其他方法是测量对测定屏障完整性的跨上皮电阻，添加病毒或化合物以刺激细胞，免疫荧光以及RNA，蛋白质或上清液收集。这项技术为研究人员探索新的肺部生物学和疾病问题铺平了道路，例如SARS COVID-2等病毒或电子烟蒸气等化合物如何影响肺泡上皮。
