Bu protokol, akciğerdeki önemli bir hücre popülasyonunun kültürlenmesi ve geçirilmesi için bir yöntem özetler ve çevresel maruziyet için fizyolojik olarak ilgili bir platform oluşturur. Bu tekniğin temel avantajı, homeostaz ve hastalık bağlamında akciğer biyolojisini araştırmak için kullanılabilmesidir. Bu yöntem, özellikle genetik varyantların, çevresel maruziyetlerin, bulaşıcı ajanların veya bu faktörlerin bir kombinasyonunun neden olduğu akciğer alveollerini etkileyen akciğer hastalıkları hakkında bilgi sağlayabilir.
Prosedürü gösteren, MD, doktora öğrencisi Kristy Abo ve laboratuvarlarımızdan bir laboratuvar yöneticisi olan Olivia Hix tarafından desteklenen ben ve Rhiannon Werder olacak. İlk olarak, 12 delikli plakadaki yönlendirilmiş farklılaşmadan türetilen alveosferleri içeren 3D matris damlacıklarından tüm CK DCI ortamını aspire edin. Damlacık başına bir mililitre dispase ekleyin.
Bir P-1000 pipet kullanarak damlacığı yavaşça dispase içine pipetleyin. Kuluçkadan sonra, ayrışmış organoidleri dispazdaki bir matris damlacığından 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. 10 mililitre Iscove's Modified Dulbecco's Medium ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
Süpernatantı mümkün olduğunca aspire edin. Hücreleri damlacık başına% 0.05 tripsin bir mililitrede yeniden askıya alın ve 12 delikli plakaya geri aktarın. Mikroskop altında ayrışmayı gözlemlemeden önce bunu 12 ila 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve hücreleri aşırı pipetlemekten kaçının.
Kuluçka sonunda tek hücreli bir süspansiyon elde edilir. Tripsinin etkisini, eşit miktarda fetal sığır serumu içeren ortam ile durdurun, ardından beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Bir sonraki santrifüjlemeden önce hücreleri 10 mililitre IMDM ile yıkayın.
Hücreleri saymak için uygun bir hacimde yeniden askıya alın. Ve sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. iAT2 hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunu 3D matriste veya hava-sıvı arayüz kültürü için hücre kültürü eklerinde kaplayarak alveosferler oluşturun.
Hücreleri saydıktan sonra, 3B matriste tekrar oynatmak için istenen hücre sayısını belirleyin ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla süpernatantı çıkarın ve 3B matristeki hücreleri hızla yeniden askıya alın. Bir 3B matris damlacığını, matris damlacığında kabarcıklar oluşturmadan ve birden fazla damlacık dağıtırken hücre süspansiyonunun yerleşmesine izin vermeden bir P-200 pipet kullanarak önceden ısıtılmış 12 delikli bir plaka kuyucuğuna dağıtın.
Matris damlacıklarının polimerize olmasına izin vermek için plakayı 20 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin, ardından matris damlacığını örtmek için kuyucuk başına bir mililitre CK DCI 10 mikromolar Y-27632 ortam ekleyin. 72 saat sonra 10 mikromolar Y-27632 olmadan ortamı CK DCI olarak değiştirin ve her 48 ila 72 saatte bir taze CK DCI ile değiştirin. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta/Besin Karışımı F-12'sindeki 2D matrisi çalışma çözeltisine seyrelterek kullanımdan bir saat önce taze kaplanmış 6,5 milimetre hücre kültürü ekleri hazırlayın.
Ardından, 6,5 milimetrelik hücre kültürü eki başına 100 mikrolitre seyreltilmiş matris ekleyin. Matriksin 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 30 dakika boyunca veya bir saatten itibaren oda sıcaklığında polimerize olmasına izin verin. Bir pipet kullanarak hücre kültürü eklerinden fazla matrisi aspire edin.
DMEM F-12 ile durulayın ve hücreleri eklemeden önce hemen bu yıkamayı aspire edin. Hücreleri beş dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin ve mümkün olduğunca fazla süpernatantı çıkarın. Hücre kültürü eki başına 100 mikrolitre CK DCI 10 mikromolar Y-27632 ile tohuma uygun hacimdeki hücreleri askıya alın ve hücre kültürü ekinin apikal bölmesine 100 mikrolitre ekleyin.
Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı çapraz düzende hafifçe çalkalayın ve 10X hedefinde mikroskop altında kontrol edin. Her hücre kültürü ekinin bazolateral bölmesine 500 mikrolitre CK DCI 10 mikromolar Y-27632 ekleyin ve tohumlamadan 48 saat sonra, hava-sıvı arayüzünü başlatmak için bir pipet kullanarak apikal ortamı aspire edin. 72 saat sonra bazolateral ortamı 10 mikromolar Y-27632 olmadan CK DCI olarak değiştirin, ardından bazolateral ortamı kaplama sonrası 28 güne kadar her 48 ila 72 saatte bir taze CK DCI ile değiştirin.
Temsili akış sitometrisi sonuçları, endojen sürfaktan protein C lokusunu hedefleyen bir tdDomates raporlayıcısına sahip SPC2 hattı için görselleştirme kolaylığını ve kültürde zaman içinde tip 2 alveoler epitel hücrelerinin izlenmesini göstermektedir. IPSC kaynaklı alveolar tip 2 hücre yüzey aktif madde proteini C tdDomates ekspresyonu, 3D matriste küreler halinde yeniden kaplandığında ve hücre kültürü ekleri üzerine kaplandığında korunmuştur. Transepitelyal elektrik direnci, hava-sıvı arayüz kültürünün bütünlüğünü belirlemek için ölçülebilir.
Bu prosedürü denerken, mekanik pipetleme veya enzimatik sindirim ile aşırı ayrışmadan kaçının, çünkü bu düşük hücre canlılığına ve zayıf sağkalıma neden olabilir. Bu işlemden sonra yapılan ek yöntemler, tahlil bariyer bütünlüğüne transepitelyal elektriksel direncin ölçülmesi, hücreleri uyarmak için virüslerin veya bileşiklerin eklenmesi, immünofloresan ve RNA, protein veya süpernatant toplanmasıdır. Bu teknik, araştırmacıların SARS COVID-2 gibi virüslerin veya elektronik sigara buharları gibi bileşiklerin alveoler epiteli nasıl etkilediği gibi yeni akciğer biyolojisi ve hastalık sorularını keşfetmelerinin yolunu açtı.
