이 프로토콜은 폐에서 중요한 세포 집단을 배양하고 통과시키는 방법을 설명하고 환경 노출을위한 생리 학적 관련 플랫폼을 수립합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 항상성 및 질병의 맥락에서 폐 생물학을 조사하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 특히 유전 적 변이, 환경 노출, 감염원 또는 이러한 요인의 조합에 의해 유발 된 것을 포함하여 폐포에 영향을 미치는 폐 질환에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 저와 Rhiannon Werder가 MD, PhD 학생 인 Kristy Abo와 우리 실험실의 실험실 관리자 인 Olivia Hix의 도움을 받아 이루어질 것입니다. 먼저, 지시된 분화로부터 유래된 폐포구를 함유하는 3D 매트릭스 액적으로부터 모든 CK DCI 배지를 12-웰 플레이트에서 흡인한다. 물방울 당 한 밀리리터의 디스 파제를 넣으십시오.
P-1000 피펫을 사용하여 디스파제 내로 액적을 부드럽게 피펫한다. 인큐베이션 후 해리된 오가노이드를 디스파제 내의 하나의 매트릭스 액적으로부터 15-밀리리터 원뿔형 튜브로 옮긴다. Iscove의 변형 Dulbecco 배지 10 밀리리터를 넣고 실온에서 5 분 동안 300 x g에서 원심 분리하십시오.
가능한 한 상청액을 흡인하십시오. 세포를 액적 당 0.05 % 트립신 1 밀리리터에 재현탁하고 12 웰 플레이트로 다시 옮깁니다. 현미경으로 해리를 관찰하기 전에 이것을 섭씨 37도에서 12 내지 15분 동안 인큐베이션하고 세포를 피펫팅하는 것을 피한다.
인큐베이션이 끝나면 단일 세포 현탁액이 얻어집니다. 트립신의 작용을 동일한 부피의 태아 소 혈청 함유 배지로 중단하고, 300 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 다음 원심분리 전에 10 밀리리터의 IMDM으로 세포를 세척하십시오.
계수를 위해 적절한 부피로 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. iAT2 세포의 단일 세포 현탁액을 3D 매트릭스 또는 공기-액체 계면 배양을 위한 세포 배양 인서트에 도금하여 폐포권을 생성합니다.
세포를 계수한 후, 3D 매트릭스에서 재생하고자 하는 세포의 수를 결정하고, 실온에서 5분 동안 300 x g에서 세포를 원심분리한다. 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 상층액을 제거하고 세포를 3D 매트릭스에 신속하게 재현탁하십시오. 매트릭스 액적에 기포를 생성하지 않고 여러 방울을 분배하는 동안 셀 현탁액이 침전되지 않도록 P-200 피펫을 사용하여 미리 예열된 12웰 플레이트의 웰에 하나의 3D 매트릭스 액적을 분배하십시오.
매트릭스 액적이 중합될 수 있도록 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 20 내지 30분 동안 놓고, 이어서 웰 당 1밀리리터의 CK DCI 10 마이크로몰의 Y-27632 배지를 첨가하여 매트릭스 액적을 덮는다. 배지를 72시간 후에 Y-27632의 10 마이크로몰이 없는 CK DCI로 변경하고 48 내지 72시간마다 신선한 CK DCI로 교체한다. Dulbecco의 변형 이글 배지 / 영양 혼합물 F-12의 2D 매트릭스를 작업 용액으로 희석하여 사용 한 시간 전에 갓 코팅 된 6.5 밀리미터 세포 배양 삽입물을 준비하십시오.
그런 다음 6.5 밀리미터 세포 배양 인서트 당 희석 매트릭스 100 마이크로리터를 첨가한다. 매트릭스가 섭씨 37도 인큐베이터에서 30분 동안 또는 실온에서 한 시간부터 중합되도록 허용한다. 피펫을 사용하여 세포 배양 인서트로부터 과량의 매트릭스를 흡인한다.
DMEM F-12로 헹구고, 세포를 추가하기 전에 즉시 이 세척을 흡인한다. 세포를 5분 동안 300 x g에서 원심분리하고 가능한 한 많은 상층액을 제거한다. 세포를 적절한 부피로 재현탁하여 세포 배양 인서트 당 100 마이크로리터의 CK DCI 10 마이크로몰 Y-27632로 시드하고 세포 배양 인서트의 정점 구획에 100 마이크로리터를 첨가한다.
세포의 균일 한 분포를 보장하기 위해 플레이트를 교차 패턴으로 부드럽게 교반하고 10X 목표에서 현미경으로 확인하십시오. 500 마이크로리터의 CK DCI 10 마이크로몰의 Y-27632를 각 세포 배양 인서트의 기저측성 구획에 첨가하고, 시딩 48시간 후, 피펫을 사용하여 정점 배지를 흡인시켜 공기-액체 계면을 개시한다. 72시간 후 기저측성 매질을 10 마이크로몰 Y-27632가 없는 CK DCI로 변경하고, 이어서 기저측성 매질을 48 내지 72시간마다 신선한 CK DCI로 교체한 후 도금 후 최대 28일 동안 하였다.
대표적인 유세포 분석 결과는 내인성 계면활성제 단백질 C 유전자좌를 표적으로 하는 tdTomato 리포터를 갖는 SPC2 라인에 대한 시각화의 용이성 및 배양에서 시간에 따른 제2형 폐포 상피 세포의 추적 프로그램을 입증한다. IPSC 유래 폐포형 2형 세포 계면활성제 단백질 C tdTomato를 구체로서 3D 매트릭스에서 재현할 때 및 세포 배양 인서트에 플레이팅할 때 발현을 유지하였다. 경상피 전기 저항은 공기-액체 계면 배양물의 완전성을 결정하기 위해 측정될 수 있다.
이 절차를 시도 할 때 기계적 피펫팅 또는 효소 소화에 의한 과도한 해리를 피하십시오.이 경우 세포 생존율이 낮고 생존율이 떨어질 수 있습니다. 이 절차 후에 수행되는 추가의 방법은 분석 장벽 완전성에 대한 경상피 전기 저항의 측정, 세포를 자극하는 바이러스 또는 화합물의 첨가, 면역형광, 및 RNA, 단백질, 또는 상청액 수집이다. 이 기술은 연구자들이 SARS COVID-2와 같은 바이러스 또는 전자 담배 증기와 같은 화합물이 폐포 상피에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 새로운 폐 생물학 및 질병 질문을 탐구 할 수있는 길을 열었습니다.
