Este protocolo describe un método para cultivar y pasar una población celular importante en el pulmón y establece una plataforma fisiológicamente relevante para la exposición ambiental. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para investigar la biología pulmonar en el contexto de la homeostasis y la enfermedad. Este método puede proporcionar información, especialmente sobre las enfermedades pulmonares que afectan a los alvéolos pulmonares, incluidas las causadas por variantes genéticas, exposiciones ambientales, agentes infecciosos o una combinación de estos factores.
Demostrando el procedimiento seremos yo y Rhiannon Werder, asistidos por Kristy Abo, md, estudiante de doctorado, y Olivia Hix, gerente de laboratorio de nuestros laboratorios. Primero, aspire todo el medio CK DCI de las gotas de la matriz 3D que contienen alveoloesferas derivadas de la diferenciación dirigida en la placa de 12 pocillos. Añadir un mililitro de dispase por gota.
Pipetee suavemente la gota en la dispasa usando una pipeta P-1000. Después de la incubación, transfiera los organoides disociados de una gota de matriz en la dispasa a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue 10 mililitros de Medium modificado de Dulbecco de Iscove y centrífuga a 300 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Aspirar el sobrenadante tanto como sea posible. Resuspender las células en un mililitro de tripsina al 0,05% por gota y transferirla de nuevo a la placa de 12 pocillos. Incubar esto a 37 grados centígrados durante 12 a 15 minutos antes de observar la disociación bajo el microscopio y evitar el sobrecanalido de las células.
Al final de la incubación se obtiene una suspensión de una sola célula. Detenga la acción de la tripsina con un volumen igual de suero fetal bovino que contenga medio, seguido de una centrífuga a 300 x g durante cinco minutos. Lave las células con 10 mililitros de IMDM antes de la próxima centrifugación.
Vuelva a suspender las celdas en un volumen apropiado para contar. Y luego cuente las células usando un hemocitómetro. Genere alveoloesferas mediante el recubrimiento de suspensión unicelular de células iAT2 en la matriz 3D o en insertos de cultivo celular para cultivo de interfaz aire-líquido.
Después de contar las células, determine el número de células deseadas para reproducir en la matriz 3D y centrífuga las células a 300 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender rápidamente las celdas en la matriz 3D. Dispense una gota de matriz 3D en un pozo de placa de 12 pocillos precalentada usando una pipeta P-200 sin crear burbujas en la gota de matriz, y sin permitir que la suspensión celular se asiente mientras dispensa múltiples gotas.
Coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius durante 20 a 30 minutos para permitir que las gotas de la matriz se polimericen, luego agregue un mililitro de micromolar CK DCI 10 de medio Y-27632 por pozo para cubrir la gota de la matriz. Cambie el medio a CK DCI sin 10 micromolares de Y-27632 después de 72 horas y reemplácelo con CK DCI fresco cada 48 a 72 horas. Prepare insertos de cultivo celular de 6,5 milímetros recién recubiertos una hora antes del uso diluyendo la matriz 2D en la mezcla de medio /nutriente F-12 Modified Eagle de Dulbecco en la solución de trabajo.
Luego agregue 100 microlitros de la matriz diluida por inserto de cultivo celular de 6.5 milímetros. Permita que la matriz polimerice en una incubadora de 37 grados Celsius durante 30 minutos o a temperatura ambiente a partir de una hora. Aspire el exceso de matriz de los insertos de cultivo celular utilizando una pipeta.
Enjuáguelo con DMEM F-12 e inmediatamente aspire este lavado antes de agregar las células. Centrifugar las células a 300 x g durante cinco minutos y retirar la mayor cantidad posible de sobrenadante. Resuspender las células en el volumen apropiado para sembrar con 100 microlitros de CK DCI 10 micromolares Y-27632 por inserto de cultivo celular y agregar 100 microlitros al compartimento apical del inserto de cultivo celular.
Agita suavemente la placa en un patrón cruzado para garantizar la distribución uniforme de las células y compruébala bajo un microscopio con el objetivo 10X. Agregue 500 microlitros de micromolar CK DCI 10 de Y-27632 al compartimiento basolateral de cada inserto de cultivo celular, y 48 horas después de la siembra, aspire el medio apical usando una pipeta para iniciar la interfaz aire-líquido. Después de 72 horas, cambie el medio basolateral a CK DCI sin 10 micromolares Y-27632, seguido de reemplazar el medio basolateral con CK DCI fresco cada 48 a 72 horas durante un máximo de 28 días después del revestimiento.
Los resultados representativos de la citometría de flujo demuestran la facilidad de visualización para la línea SPC2 que tiene un reportero tdTomato dirigido al locus endógeno de la proteína C surfactante y el seguimiento de las células epiteliales alveolares tipo 2 programa a lo largo del tiempo en cultivo. La expresión de la proteína surfactante celular alveolar tipo 2 derivada de IPSC C tdTomato se mantuvo cuando se volvió a platear en la matriz 3D como esferas y cuando se enchapó en insertos de cultivo celular. La resistencia eléctrica transepitelial se puede medir para determinar la integridad del cultivo de interfaz aire-líquido.
Al intentar este procedimiento, evite la disociación excesiva mediante pipeteo mecánico o digestión enzimática, ya que esto puede conducir a una baja viabilidad celular y una supervivencia deficiente. Los métodos adicionales realizados después de este procedimiento son las mediciones de la resistencia eléctrica transepitelial a la integridad de la barrera del ensayo, la adición de virus o compuestos para estimular las células, la inmunofluorescencia y la recolección de ARN, proteínas o sobrenadantes. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploren nuevas preguntas sobre biología pulmonar y enfermedades, como cómo virus como el SARS COVID-2 o compuestos como los vapores de cigarrillos electrónicos afectan el epitelio alveolar.
