Ce protocole décrit une méthode de culture et de passage d’une importante population cellulaire dans le poumon et établit une plate-forme physiologiquement pertinente pour l’exposition environnementale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour étudier la biologie pulmonaire dans le contexte de l’homéostasie et de la maladie. Cette méthode peut fournir des informations, en particulier sur les maladies pulmonaires affectant les alvéoles pulmonaires, y compris celles causées par des variantes génétiques, des expositions environnementales, des agents infectieux ou une combinaison de ces facteurs.
La démonstration de la procédure sera faite par Moi-même et Rhiannon Werder, assistée de Kristy Abo, MD, doctorante, et Olivia Hix, responsable de laboratoire de nos laboratoires. Tout d’abord, aspirer tout le milieu CK DCI à partir des gouttelettes de matrice 3D contenant des alvéolosphères dérivées de la différenciation dirigée dans la plaque à 12 puits. Ajouter un millilitre de dispase par gouttelette.
Pipettez doucement la gouttelette dans la dispase à l’aide d’une pipette P-1000. Après l’incubation, transférez les organoïdes dissociés d’une gouttelette de matrice dans la dispase dans un tube conique de 15 millilitres. Ajouter 10 millilitres de Dulbecco’s Medium modifié d’Iscove et centrifuger à 300 x g pendant cinq minutes à température ambiante.
Aspirez le surnageant autant que possible. Resuspendez les cellules dans un millilitre de 0,05% de trypsine par gouttelette et transférez-les dans la plaque de 12 puits. Incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 12 à 15 minutes avant d’observer la dissociation au microscope et évitez de trop pipeter les cellules.
À la fin de l’incubation, une suspension unicellulaire est obtenue. Arrêter l’action de la trypsine avec un volume égal de sérum bovin fœtal contenant un milieu, suivi d’une centrifugeuse à 300 x g pendant cinq minutes. Lavez les cellules avec 10 millilitres d’IMDM avant la prochaine centrifugation.
Remettez en suspension les cellules dans un volume approprié pour le comptage. Et puis comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Générer des alvéolosphères en plaquant une suspension unicellulaire de cellules iAT2 dans la matrice 3D ou sur des inserts de culture cellulaire pour la culture d’interface air-liquide.
Après avoir compté les cellules, déterminez le nombre de cellules souhaitées à rejouer dans la matrice 3D et centrifugez les cellules à 300 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez autant de surnageant que possible à l’aide d’une pipette et remettez rapidement en suspension les cellules de la matrice 3D. Distribuer une gouttelette de matrice 3D dans un puits de plaque préavertissée de 12 puits à l’aide d’une pipette P-200 sans créer de bulles dans la gouttelette de matrice et sans permettre à la suspension cellulaire de se déposer tout en distribuant plusieurs gouttelettes.
Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour permettre aux gouttelettes de la matrice de polymériser, puis ajoutez un millilitre de milieu CK DCI 10 de milieu Y-27632 par puits pour couvrir la gouttelette de matrice. Changez le milieu en CK DCI sans 10 micromolaires de Y-27632 après 72 heures et remplacez-le par un CK DCI frais toutes les 48 à 72 heures. Préparez des inserts de culture cellulaire de 6,5 millimètres fraîchement enduits une heure avant l’utilisation en diluant la matrice 2D dans le mélange modifié Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 de Dulbecco dans la solution de travail.
Ajoutez ensuite 100 microlitres de la matrice diluée par insert de culture cellulaire de 6,5 millimètres. Laissez la matrice polymériser dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes ou à température ambiante à partir d’une heure. Aspirer l’excès de matrice des inserts de culture cellulaire à l’aide d’une pipette.
Rincez-le avec du DMEM F-12 et aspirez immédiatement ce lavage avant d’ajouter les cellules. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant cinq minutes et retirez autant de surnageant que possible. Remettre les cellules dans le volume approprié pour ensemencer avec 100 microlitres de CK DCI 10 micromolaires Y-27632 par insert de culture cellulaire et ajouter 100 microlitres au compartiment apical de l’insert de culture cellulaire.
Agitez doucement la plaque en croix pour assurer la répartition uniforme des cellules et vérifiez-la au microscope à l’objectif 10X. Ajouter 500 microlitres de CK DCI 10 micromolaires de Y-27632 au compartiment basolatéral de chaque insert de culture cellulaire et, 48 heures après l’ensemencement, aspirer le milieu apical à l’aide d’une pipette pour initier l’interface air-liquide. Après 72 heures, changer le milieu basolatéral en CK DCI sans 10 micromolaires Y-27632, puis remplacer le milieu basolatéral par un DCI CK frais toutes les 48 à 72 heures pendant 28 jours après le placage.
Les résultats représentatifs de la cytométrie en flux démontrent la facilité de visualisation pour la lignée SPC2 ayant un rapporteur tdTomato ciblé sur le locus de la protéine C du tensioactif endogène et le suivi du programme des cellules épithéliales alvéolaires de type 2 au fil du temps en culture. L’expression de la protéine C tdTomato de la protéine tensioactif alvéolaire de type 2 dérivée de l’IPSC a été maintenue lorsqu’elle a été replaquée dans la matrice 3D sous forme de sphères et lorsqu’elle a été plaquée sur des inserts de culture cellulaire. La résistance électrique transépithéliale peut être mesurée pour déterminer l’intégrité de la culture de l’interface air-liquide.
Lorsque vous essayez cette procédure, évitez la dissociation excessive par pipetage mécanique ou digestion enzymatique, car cela peut entraîner une faible viabilité cellulaire et une mauvaise survie. D’autres méthodes effectuées après cette procédure sont des mesures de la résistance électrique transépithéliale à l’intégrité de la barrière de dosage, l’ajout de virus ou de composés pour stimuler les cellules, l’immunofluorescence et la collecte d’ARN, de protéines ou de surnageants. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer de nouvelles questions de biologie pulmonaire et de maladies, telles que la façon dont des virus comme le SRAS COVID-2 ou des composés comme les vapeurs de cigarette électronique affectent l’épithélium alvéolaire.
