هذا البروتوكول مفيد لأنه يوفر خطوات سهلة المتابعة تسمح بتوليد خلايا ظهارية وظيفية في مجرى الهواء ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لدراسة جوانب مختلفة من بيولوجيا مجرى الهواء. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي القدرة على توليد العديد من مزارع الخلايا الظهارية الوظيفية في مجرى الهواء مع تجنب صعوبات الحصول على خلايا مجرى الهواء الأولية وزراعتها في نفس الوقت. سيوضح الإجراء تايلور ماتي ، طالب الدراسات العليا من مختبرنا.
ابدأ بإذابة حجم كاف من مصفوفة 3D على الجليد. احتفظ به على الجليد حتى يصبح جاهزا للاستخدام. قم بإذابة قارورة من معلقات الخلايا المفردة المحفوظة سابقا بالتجميد من iBCs عن طريق احتضانها في حمام ماء أو خرز 37 درجة مئوية حتى لا تكون هناك وسائط مجمدة مرئية.
باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلترات ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. أضف ستة إلى 10 ملليلتر من DMEM / F12 قطرة إلى تعليق الخلية. اخلطي بلطف وقم بالطرد المركزي عند 300 RCF لمدة خمس دقائق لتكوير الخلايا.
قم بشفط السوبرناتانت وإعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلتر واحد من وسط الخلايا القاعدية باستخدام ماصة دقيقة P1000. إعداد 10 ميكرولتر aliquot وإجراء عدد الخلايا. الطرد المركزي للخلايا في 300 RCF لمدة خمس دقائق.
شفط supernatant وإعادة تعليق الخلايا بكثافة 4،000 خلية لكل ميكرولتر في مصفوفة 3D التي تم إذابتها سابقا باستخدام ماصة دقيقة P1000. باستخدام ماصة دقيقة P200 ، أضف قطرة من محلول المصفوفة المقابلة لما يقرب من 25 إلى 50 ميكرولتر إلى قاعدة كل بئر من لوحة معالجة بزراعة الأنسجة من 12 بئرا. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا.
ثم أضف ما يكفي من وسط الخلايا القاعدية إلى كل بئر لغمر القطرة بالكامل باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلترات. أعد اللوحة إلى حاضنة رطبة. تغذية الخلايا كل يومين باستخدام وسط الخلايا القاعدية الطازجة.
أضف وسطا طازجا إلى جانب البئر باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر ، مع الحرص على عدم إزعاج قطرات الخلايا. إذابة حجم كاف من مصفوفة 3D على الجليد. احتفظ به على الجليد حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
بعد ما يقرب من خمسة إلى سبعة أيام من احتضان لوحات الاستزراع ، قم بشفط الوسط من كل بئر ، ثم باستخدام ماصة دقيقة P1000 ، أضف ملليلتر واحد من dispase II مباشرة إلى الكرويات للانفصال عن قطرة المصفوفة. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. باستخدام ماصة دقيقة P1000 ، امزج الديسباز عن طريق السحب لأعلى ولأسفل مرتين ، مما يؤدي إلى تفتيت كتل كبيرة من مصفوفة 3D.
أعد اللوحة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 40 دقيقة إضافية ، مما يسمح للمصفوفة بالذوبان تماما. عندما لا تكون قطرة المصفوفة ثلاثية الأبعاد مرئية تحت المجهر الضوئي ، أضف الكرويات العائمة بحرية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر باستخدام طرف ماصة مصلية سعة خمسة ملليلترات. أضف DMEM / F12 للحصول على حجم نهائي قدره 10 ملليلتر لكل أنبوب مخروطي وأجهزة طرد مركزي عند 200 RCF لمدة ثلاث دقائق لتكوير الكرويات.
استنشق السوبرناتانت وأضف ملليلتر واحد من 0.05٪ من التربسين لكل قطرة أولية مفككة. احتضنها عند 37 درجة مئوية ، وقم بتثبيتها كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق. تقييم الحل باستخدام المجهر الضوئي كل بضع دقائق.
عندما يتم فصل أكثر من 90٪ من الكرويات إلى خلايا مفردة ، أضف 10٪ مصل بقري جنيني إلى التربسين. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي في 300 RCF لمدة خمس دقائق. قم بإجراء عدد الخلايا وأعد تعليق الخلايا بالتساوي بكثافة 400 خلية لكل ميكرولتر من مصفوفة 3D المذابة.
تجنب إدخال فقاعات الهواء. أعد تعليق أكبر عدد ممكن من القطرات حسب الحاجة للتطبيق النهائي. كرر هذه العملية لكل بئر.
بعد 10 إلى 14 يوما من أحدث مرور ، قم بفصل الكرويات إلى تعليق خلية واحدة كما هو موضح سابقا وقم بإجراء عدد الخلايا. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للفرز. سيكون هذا هو السكان الرئيسيون.
انقل أليكوت صغير من 25 إلى 50 ميكرولتر إلى أنبوب منفصل. سيكون هذا هو عدد السكان القاصرين. أضف الأجسام المضادة المترافقة المضادة ل NGFR إلى مجموعة الخلايا الرئيسية.
إضافة الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل إلى مجموعة الخلايا البسيطة. حماية الخلايا من الضوء والاحتفاظ بها على الجليد لمدة 30 دقيقة بشكل متقطع Triturate الخلايا لمنع التكوير. بعد 30 دقيقة ، أضف المخزن المؤقت للفرز إلى كل أنبوب من الخلايا.
خلايا الطرد المركزي في 300 RCF لمدة خمس دقائق. شفط supernatant ، وإعادة تعليق الخلايا الكروية في المخزن المؤقت للفرز وإضافة بقعة خلية حية أو ميتة. باستخدام استراتيجية بوابة NGFR الإيجابية المناسبة ، قم بفرز ما يكفي من الخلايا الإيجابية NGFR للتطبيقات الضرورية في المراحل النهائية.
قم بإعداد إدخالات غشاء مسامي 6.5 ملم عن طريق إضافة مصفوفة 200 ميكرولتر إلى الغرفة القمية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ضعه في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل الحاجة. استنشاق مصفوفة الطلاء من الغرفة القمية للإدراج.
أضف 500 ميكرولتر من وسط الخلايا القاعدية إلى الغرفة القاعدية. أعد تعليق ما لا يقل عن 30،000 خلية إيجابية NGFR مفروزة في 100 إلى 200 ميكرولتر من الخلايا القاعدية المتوسطة ونقلها إلى الغرفة القمية باستخدام ماصة دقيقة P200. كرر ذلك للآبار المتبقية.
ضع اللوحة في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية. في غضون يومين إلى ثلاثة أيام ، قم بشفط الغرف القمية والقاعدية الجانبية وتغذيتها بوسط الخلايا القاعدية الطازج. راقب الغرفة القمية يوميا باستخدام المجهر الضوئي.
عندما تصل الخلايا إلى أكثر من 80٪ من الالتقاء ، استبدل وسط الخلايا القاعدية بوسط تمايز ALI في كل من الغرف القمية والقاعدية. قم بحماية وسيط التمايز ALI من الضوء عن طريق إبقاء حاويات الوسائط ملفوفة بورق القصدير وعن طريق إطفاء المصابيح العلوية عندما يكون ذلك ممكنا. في اليوم التالي ، استنشق الوسط من الغرفة القمية ، وبالتالي تعريض السطح القمي للهواء.
استبدال وسائط التمايز ALI في الغرفة القاعدية كل يومين إلى ثلاثة أيام. راقب مظهر الثقافة كل يوم أو يومين. استنشق بعناية أي سائل متراكم من الغرفة القمية دون إزعاج طبقة الخلية.
أضف بلطف 100 ميكرولتر من PBS بدون كالسيوم أو مغنيسيوم إلى الغرفة القمية لإزالة الحطام أو المخاط. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم شفط بعناية PBS. تقييم TEER من أجل السلامة الظهارية.
بعد سبعة إلى 10 أيام من التعرض للهواء ، راقب ظهور تعدد الأهداب باستخدام المجهر الضوئي. اعتمادا على التجربة والقراءة المخطط لها ، يمكن تحليل الخلايا بعد 14 إلى 28 يوما من التعرض للهواء. بعد 10 إلى 14 يوما من أحدث ممر للثقافة ثلاثية الأبعاد ، قم بفصل الكرويات إلى تعليق خلية واحدة كما هو موضح سابقا.
قم بإجراء عدد الخلايا ، وأعد تعليق تعليق الخلية في وسط الحفظ بالتبريد في التبريد. ضع الكريوفيالات في وعاء لضمان انخفاض ثابت في درجة الحرارة. والانتقال إلى ناقص 80 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة يليه النقل إلى 150 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين على المدى الطويل.
باستخدام تقنية البوابات هذه ، كانت 28٪ من الخلايا المفردة الحية إيجابية NGFR. بعد يومين ، كان من السهل التعرف على الخلايا الفردية في البداية وكان لها مظهر ممدود على شكل مغزل. بعد يومين آخرين ، شكلت الخلايا طبقة أحادية متقاربة ومعبأة بشكل فضفاض.
على مدى الأيام اللاحقة إلى الأسابيع ، شكلت الخلايا طبقة ظهارية معبأة بإحكام وعالية الخلايا. وبعد سبعة إلى 10 أيام ، كان هناك ظهور واضح لضرب الأهداب وإنتاج المخاط. تم قياس TEER للعينات وكانت النتائج مشابهة لقياسات عينات التحكم في الخلايا الظهارية الأولية في مجرى الهواء.
تم إجراء التثبيت اللاحق مع ألدهيد بارافورم ووضع العلامات المناعية لعلامات الخلايا الظهارية في مجرى الهواء القانوني ل MUC5AC و alpha-tubulin الأسيتيلات وغيرها. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين إنشاء عدد كبير من مزارع الخلايا الظهارية في مجرى الهواء المستمدة من المريض لتقييم القراءات المختلفة ، بما في ذلك تلك التي تختبر وظائف الخلايا القاعدية والإفرازية ومتعددة الأهداب في كل من المرض والصحة.
