このプロトコルは、機能的な気道上皮細胞の生成を可能にする手順を簡単に提供し、気道生物学のさまざまな側面を研究するために使用できるため、役立ちます。このプロトコルの主な利点は、多くの機能的な気道上皮細胞培養物を生成すると同時に、初代気道細胞の取得および培養の困難を回避する能力である。手順を実演するのは、当研究室の大学院生であるテイラー・マットです。
氷上で十分な量の3Dマトリックスを解凍することから始めます。使用準備が整うまで氷の上に保管してください。以前に凍結保存したiBCの単一細胞懸濁液のバイアルを、目に見える凍結媒体がなくなるまで摂氏37度の水またはビーズ浴中でインキュベートすることによって解凍する。
5ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移す。6~10ミリリットルのDMEM/F12を細胞懸濁液に滴下する。穏やかに混合し、300RCFで5分間遠心分離して細胞をペレット化する。
上清を吸引し、P1000マイクロピペットで1ミリリットルの基礎細胞培地に細胞ペレットを再懸濁する。10マイクロリットルのアリコートを用意し、細胞数を行う。細胞を300RCFで5分間遠心分離する。
上清を吸引し、P1000マイクロピペットで予め解凍した3Dマトリックス中にマイクロリットル当たり4,000細胞の密度で細胞を再懸濁する。P200マイクロピペットを用いて、約25〜50マイクロリットルに相当するマトリックス溶液の液滴を12ウェル組織培養処理プレートの各ウェルの基部に加える。プレートを摂氏37度で約15分間インキュベートする。
次いで、各ウェルに十分な基礎細胞培地を加え、5ミリリットルの血清学的ピペットを用いて液滴を完全に沈める。プレートを加湿インキュベーターに戻します。新鮮な基礎細胞培地を使用して2日ごとに細胞を供給します。
5ミリリットルの血清学的ピペットでウェルの側面に新鮮な培地を加え、細胞の液滴を乱さないように注意してください。氷上で十分な量の3Dマトリックスを解凍します。使用準備が整うまで氷の上に保管してください。
培養プレートを約5〜7日間インキュベートした後、各ウェルから培地を吸引し、次いでP1000マイクロピペットを使用して、1ミリリットルのディスパーゼIIをスフェロイド上に直接加えて、マトリックスの液滴から解離させる。プレートを摂氏37度のインキュベーターに10〜15分間置く。P1000マイクロピペットを使用して、ディスパーゼを上下に2回ピペッティングして混合し、3Dマトリックスの大きな塊を分解します。
プレートをさらに30〜40分間摂氏37度に戻し、マトリックスを完全に溶解させます。3Dマトリックスの液滴が光学顕微鏡下で見えなくなったら、5ミリリットルの血清学的ピペットチップを使用して、自由に浮遊する回転楕円体を15ミリリットルの円錐形チューブに追加します。円錐管あたり10ミリリットルの最終容量のDMEM/F12を加え、200RCFで3分間遠心分離して回転楕円体をペレット化する。
上清を吸引し、解離した初期液滴ごとに1ミリリットルの0.05%トリプシンを加える。摂氏37度でインキュベートし、2〜3分ごとに粉砕する。数分ごとに光学顕微鏡で溶液を評価します。
スフェロイドの90%以上が単一細胞に解離したら、10%のウシ胎児血清をトリプシンに加える。40マイクロメートルのセルストレーナーで細胞をろ過し、300RCFで5分間遠心分離します。細胞数を実行し、解凍した3Dマトリックスのマイクロリットルあたり400セルの密度で細胞を均等に再懸濁する。
気泡の導入は避けてください。ダウンストリームアプリケーションに必要な数のドロップレットを再サスペンドします。このプロセスを各ウェルに対して繰り返します。
直近継代の10〜14日後、先に実証したようにスフェロイドを単一細胞懸濁液に解離させ、細胞数を行う。セルをソートバッファーに再懸濁します。これが主な人口になります。
25〜50マイクロリットルの小さなアリコートを別のチューブに移す。これは少数人口になります。コンジュゲート抗NGFR抗体を主細胞集団に加える。
アイソタイプ対照抗体をマイナー細胞集団に加える。細胞を光から保護し、30分間氷の上に保ち、ペレット化を防ぐために細胞を断続的に粉砕する。30分後、細胞の各チューブにソートバッファーを加える。
細胞を300 RCFで5分間遠心分離する。上清を吸引し、ペレット状の細胞をソートバッファーに再懸濁し、生細胞染色または死細胞染色を加える。適切なNGFR陽性ゲーティング戦略を使用して、必要な下流用途に十分なNGFR陽性細胞を選別する。
メーカーの指示に従って、200マイクロリットルのマトリックスを頂端チャンバーに追加して、6.5ミリメートルの多孔膜インサートを準備します。必要になる前に少なくとも2時間、摂氏37度に置いてください。インサートの頂端チャンバーからコーティングマトリックスを吸引する。
500マイクロリットルの基底細胞培地を基底側チャンバーに加える。少なくとも30,000個の選別されたNGFR陽性細胞を100〜200マイクロリットルの基礎細胞培地に再懸濁し、P200マイクロピペットを用いて頂端チャンバーに移す。残りの井戸についても繰り返します。
加湿された37°Cのインキュベーターにプレートを置きます。2〜3日で、頂端および側底室を吸引し、新鮮な基底細胞培地で餌をやる。毎日、光学顕微鏡で頂端チャンバーを監視します。
細胞が80%以上のコンフルエントに達したら、頂端室と側底室の両方で基礎細胞培地をALI分化培地と交換してください。ALI差別化媒体を光から保護するには、媒体容器をホイルで包んだままにし、可能であればオーバーヘッドライトをオフにします。翌日、頂端チャンバーから培地を吸引し、頂端表面を空気に曝す。
ALI分化培地を2〜3日ごとに側底チャンバーに交換する。1〜2日ごとに培養物の外観を監視します。細胞層を乱すことなく、頂端室から蓄積された液体を慎重に吸引する。
カルシウムまたはマグネシウムを含まない100マイクロリットルのPBSを頂端チャンバーに穏やかに加え、破片または粘液を除去する。摂氏37度で10分間インキュベートし、PBSを慎重に吸引する。上皮の完全性についてTEERを評価する。
7〜10日間の空気暴露後、光学顕微鏡を用いて多毛の出現を観察する。計画された実験および読み出しに応じて、細胞は空気曝露の14〜28日後に分析され得る。最新の3D培養継代の10〜14日後、先に実証したようにスフェロイドを単一細胞懸濁液に解離させる。
細胞数を行い、細胞懸濁液を凍結保存培地に凍結懸濁してクライオバイアルに再懸濁する。クライオバイアルを容器に入れて、温度を安定的に下げます。そして、マイナス80°Cに24〜48時間移し、その後、長期保存のためにマイナス150°Cに移します。
このゲーティング技術では、生単一細胞の28%がNGFR陽性であった。2日後、個々の細胞は最初は容易に識別可能であり、細長い紡錘形の外観を有していた。さらに2日後、細胞はコンフルエントでゆるやかに充填された単分子膜を形成した。
その後の数日から数週間にわたって、細胞は密集した高度に細胞上皮層を形成した。そして7〜10日後、繊毛と粘液の生産を打つという明確な出現がありました。試料のTEERを測定し、その結果は、原発性気道上皮細胞対照試料の測定と同様であった。
その後のパラホルムアルデヒドによる固定および正準気道上皮細胞マーカーに対する免疫標識を、とりわけMUC5ACおよびアセチル化α-チューブリンについて行った。このプロトコールに従って、研究者は多数の患者由来の気道上皮細胞培養物を生成して、疾患および健康の両方における基底細胞、分泌細胞、および多毛細胞の機能をテストするものを含む、さまざまな読み出しを評価することができる。
