Questo protocollo è utile perché fornisce passaggi facili da seguire che consentono la generazione di cellule epiteliali funzionali delle vie aeree, che possono quindi essere utilizzate per studiare vari aspetti della biologia delle vie aeree. Il vantaggio principale di questo protocollo è la capacità di generare molte colture cellulari epiteliali funzionali delle vie aeree evitando contemporaneamente le difficoltà di ottenere e coltivare cellule primarie delle vie aeree. A dimostrare la procedura sarà Taylor Matte, uno studente laureato del nostro laboratorio.
Inizia scongelando un volume sufficiente di matrice 3D sul ghiaccio. Tenerlo sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Scongelare una fiala di sospensioni monocellulari di iBC precedentemente crioconservate incubandola in un bagno di acqua o perline a 37 gradi Celsius fino a quando non ci sono mezzi congelati visibili.
Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere da sei a 10 millilitri di DMEM/F12 a goccia alla sospensione cellulare. Mescolare delicatamente e centrifugare a 300 RCF per cinque minuti per pellettare le celle.
Aspirare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in un millilitro di Basal Cell Medium con una micropipetta P1000. Preparare un'aliquota di 10 microlitri ed eseguire un conteggio delle cellule. Centrifugare le celle a 300 RCF per cinque minuti.
Aspirare il surnatante e risospese le cellule ad una densità di 4.000 cellule per microlitro nella matrice 3D precedentemente scongelata con una micropipetta P1000. Con una micropipetta P200, aggiungere una goccia della soluzione di matrice corrispondente a circa 25-50 microlitri alla base di ciascun pozzetto di una piastra trattata con coltura tissutale a 12 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per circa 15 minuti.
Quindi aggiungere abbastanza mezzo a cellule basali a ciascun pozzetto per immergere completamente la goccia usando una pipetta sierologica da cinque millilitri. Riportare la piastra in un incubatore umidificato. Nutrire le cellule ogni due giorni usando il mezzo cellulare basale fresco.
Aggiungere il mezzo fresco sul lato del pozzo con una pipetta sierologica da cinque millilitri, facendo attenzione a non disturbare la goccia di cellule. Scongelare un volume sufficiente della matrice 3D sul ghiaccio. Tenerlo sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
Dopo circa cinque-sette giorni di incubazione delle piastre di coltura, aspirare il mezzo da ciascun pozzetto, quindi utilizzando una micropipetta P1000, aggiungere un millilitro di dispasiO II direttamente sugli sferoidi per dissociarsi dalla goccia della matrice. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Utilizzando una micropipetta P1000, mescolare la dispase pipettando su e giù due volte, rompendo grandi grumi della matrice 3D.
Riportare la piastra a 37 gradi Celsius per altri 30-40 minuti, consentendo alla matrice di dissolversi completamente. Quando la goccia della matrice 3D non è più visibile al microscopio ottico, aggiungere gli sferoidi liberamente fluttuanti a un tubo conico da 15 millilitri utilizzando una punta della pipetta sierologica da cinque millilitri. Aggiungere DMEM/F12 per un volume finale di 10 millilitri per tubo conico e centrifugare a 200 RCF per tre minuti per pellettizzare gli sferoidi.
Aspirare il surnatante e aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,05% per ogni goccia iniziale dissociata. Incubare a 37 gradi Celsius, triturandolo ogni due o tre minuti. Valutare la soluzione con il microscopio ottico ogni pochi minuti.
Quando più del 90% degli sferoidi sono stati dissociati a singole cellule, aggiungere il 10% di siero bovino fetale alla tripsina. Filtrare le cellule attraverso un filtro a celle da 40 micrometri e centrifugare a 300 RCF per cinque minuti. Eseguire un conteggio delle cellule e risospese uniformemente le celle a una densità di 400 celle per microlitro di matrice 3D scongelata.
Evitare di introdurre bolle d'aria. Risospesciare tutte le goccioline necessarie per l'applicazione a valle. Ripeti questo processo per ogni pozzo.
Dopo 10-14 giorni dal passaggio più recente, dissociare gli sferoidi in una sospensione a singola cellula come dimostrato in precedenza ed eseguire un conteggio cellulare. Sospendere nuovamente le celle nel buffer di ordinamento. Questa sarà la popolazione principale.
Trasferire una piccola aliquota da 25 a 50 microlitri in un tubo separato. Questa sarà la popolazione minore. Aggiungere anticorpi anti-NGFR coniugati alla popolazione cellulare principale.
Aggiungere anticorpi di controllo dell'isotipo alla popolazione cellulare minore. Proteggere le cellule dalla luce e tenerle sul ghiaccio per 30 minuti a intermittenza Triturare le cellule per evitare la pellettizzazione. Dopo 30 minuti, aggiungere il buffer di ordinamento a ciascun tubo di celle.
Centrifugare le celle a 300 RCF per cinque minuti. Aspirare il surnatante, risospesciare le cellule pellettate nel tampone di ordinamento e aggiungere la macchia di cellule vive o morte. Utilizzando un'appropriata strategia di gating NGFR positivo, ordinare abbastanza celle positive NGFR per le necessarie applicazioni a valle.
Preparare inserti a membrana porosa da 6,5 millimetri aggiungendo una matrice da 200 microlitri alla camera apicale secondo le istruzioni del produttore. Posizionarlo a 37 gradi Celsius per almeno due ore prima del necessario. Aspirare la matrice di rivestimento dalla camera apicale dell'inserto.
Aggiungere 500 microlitri del mezzo cellulare basale alla camera basolaterale. Sospendere almeno 30.000 cellule NGFR positive selezionate in 100-200 microlitri Basal Cell Medium e trasferire alla camera apicale utilizzando una micropipetta P200. Ripetere per i pozzi rimanenti.
Posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius. In due o tre giorni, aspirare le camere apicali e basolaterali e nutrirsi con il mezzo cellulare basale fresco. Monitorare quotidianamente la camera apicale con la microscopia ottica.
Quando le cellule raggiungono una confluenza superiore all'80%, sostituire il mezzo cellulare basale con il mezzo di differenziazione ALI sia nelle camere apicali che basolaterali. Proteggere il mezzo di differenziazione ALI dalla luce mantenendo i contenitori dei supporti avvolti in un foglio e spegnendo le luci a soffitto quando possibile. Il giorno dopo, aspirare il mezzo dalla camera apicale, esponendo così la superficie apicale all'aria.
Sostituire i mezzi di differenziazione ALI nella camera basolaterale ogni due o tre giorni. Monitorare l'aspetto della cultura ogni uno o due giorni. Aspirare accuratamente qualsiasi liquido accumulato dalla camera apicale senza disturbare lo strato cellulare.
Aggiungere delicatamente 100 microlitri di PBS senza calcio o magnesio alla camera apicale per rimuovere detriti o muco. Incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti e quindi aspirare accuratamente PBS. Valutare il TEER per l'integrità epiteliale.
Dopo sette o 10 giorni di esposizione all'aria, osservare per la comparsa di multicilia utilizzando la microscopia ottica. A seconda dell'esperimento pianificato e della lettura, le cellule possono essere analizzate dopo 14-28 giorni di esposizione all'aria. Dopo 10-14 giorni dal più recente passaggio della coltura 3D, dissociare gli sferoidi in sospensione a singola cellula come dimostrato in precedenza.
Eseguire un conteggio cellulare, risospese la sospensione cellulare in mezzo di crioconservazione in un crioviale. Mettere le crioviali in un contenitore per garantire un calo costante della temperatura. E trasferisci a meno 80 gradi Celsius per 24-48 ore seguito dal trasferimento a meno 150 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.
Con questa tecnica di gating, il 28% delle singole cellule vive erano NGFR positive. Dopo due giorni, le singole cellule erano inizialmente facilmente identificabili e avevano un aspetto allungato a forma di fuso. Dopo altri due giorni, le cellule formarono un monostrato confluente e vagamente imballato.
Nei giorni successivi o nelle settimane, le cellule hanno formato uno strato epiteliale strettamente imballato e altamente cellulare. E dopo sette o 10 giorni, c'era una chiara emergenza di battere le ciglia e la produzione di muco. Il TEER dei campioni è stato misurato e i risultati sono stati simili alle misurazioni dei campioni di controllo delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree.
La successiva fissazione con aldeide paraforme e immunolabeling per i marcatori delle cellule epiteliali canoniche delle vie aeree è stata eseguita per MUC5AC e alfa-tubulina acetilata, tra gli altri. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono generare un gran numero di colture cellulari epiteliali delle vie aeree derivate dal paziente per valutare varie letture, comprese quelle che testano le funzioni delle cellule basali, secretorie e multiciliate sia nella malattia che nella salute.
