Dieses Protokoll ist hilfreich, da es einfach zu befolgende Schritte bietet, die die Erzeugung funktioneller Atemwegsepithelzellen ermöglichen, mit denen dann verschiedene Aspekte der Atemwegsbiologie untersucht werden können. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Fähigkeit, viele funktionelle Atemwegsepithelzellkulturen zu erzeugen und gleichzeitig die Schwierigkeiten bei der Gewinnung und Kultivierung primärer Atemwegszellen zu vermeiden. Taylor Matte, ein Doktorand aus unserem Labor, wird das Verfahren demonstrieren.
Beginnen Sie mit dem Auftauen eines ausreichenden Volumens der 3D-Matrix auf Eis. Halten Sie es auf Eis, bis es einsatzbereit ist. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit zuvor kryokonservierten Einzelzellsuspensionen von iBCs auf, indem Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasser- oder Perlenbad inkubieren, bis keine sichtbaren gefrorenen Medien mehr vorhanden sind.
Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette auf eine 15-Milliliter-Konustube. Fügen Sie der Zellsuspension sechs bis 10 Milliliter DMEM/F12 tropfenweise hinzu. Vorsichtig mischen und bei 300 RCF für fünf Minuten zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.
Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Basalzellmedium mit einer P1000-Mikropipette. Bereiten Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot vor und führen Sie eine Zellzählung durch. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 RCF für fünf Minuten.
Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 4.000 Zellen pro Mikroliter in der zuvor aufgetauten 3D-Matrix mit einer P1000-Mikropipette. Mit einer P200-Mikropipette fügen Sie einen Tröpfchen der Matrixlösung, der etwa 25 bis 50 Mikrolitern entspricht, in die Basis jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekultur-behandelten Platte hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für ca. 15 Minuten.
Fügen Sie dann genügend Basalzellmedium zu jeder Vertiefung hinzu, um das Tröpfchen mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette vollständig zu tauchen. Bringen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator zurück. Füttern Sie die Zellen alle zwei Tage mit frischem Basalzellmedium.
Fügen Sie frisches Medium an der Seite des Brunnens mit einer serologischen Pipette von fünf Millilitern hinzu und achten Sie darauf, das Zelltröpfchen nicht zu stören. Tauen Sie ein ausreichendes Volumen der 3D-Matrix auf Eis auf. Halten Sie es auf Eis, bis es einsatzbereit ist.
Nach etwa fünf bis sieben Tagen Inkubation von Kulturplatten saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung ab und geben Sie dann mit einer P1000-Mikropipette einen Milliliter Dispase II direkt auf die Sphäroide, um vom Tröpfchen der Matrix zu dissoziieren. Legen Sie die Platte für 10 bis 15 Minuten in einen 37 Grad Celsius Inkubator. Mischen Sie die Dispase mit einer P1000-Mikropipette, indem Sie zweimal nach oben und unten pipettieren und große Klumpen der 3D-Matrix aufbrechen.
Bringen Sie die Platte für weitere 30 bis 40 Minuten auf 37 Grad Celsius zurück, damit sich die Matrix vollständig auflösen kann. Wenn der Tropfen der 3D-Matrix unter dem Lichtmikroskop nicht mehr sichtbar ist, fügen Sie die frei schwebenden Sphäroide mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipettenspitze zu einem 15-Milliliter-konischen Rohr hinzu. DMEM/F12 für ein Endvolumen von 10 Millilitern pro konischem Röhrchen zugeben und bei 200 RCF drei Minuten zentrifugieren, um die Sphäroide zu pelletieren.
Saugen Sie den Überstand ab und fügen Sie einen Milliliter 0,05% Trypsin für jedes anfängliche dissoziierte Tröpfchen hinzu. Bei 37 Grad Celsius inkubieren und alle zwei bis drei Minuten verwirren. Bewerten Sie die Lösung alle paar Minuten mit dem Lichtmikroskop.
Wenn mehr als 90% der Sphäroide zu einzelnen Zellen dissoziiert wurden, fügen Sie dem Trypsin 10% fetales Rinderserum hinzu. Filtern Sie die Zellen fünf Minuten lang durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb und eine Zentrifuge bei 300 RCF. Führen Sie eine Zellzählung durch und suspendieren Sie die Zellen gleichmäßig mit einer Dichte von 400 Zellen pro Mikroliter aufgetauter 3D-Matrix.
Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen. Suspendieren Sie so viele Tröpfchen wie für die nachgeschaltete Anwendung erforderlich. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Vertiefung.
Nach 10 bis 14 Tagen der letzten Passage dissoziieren Sie die Sphäroide zu einer einzelnen Zellsuspension, wie zuvor gezeigt, und führen Sie eine Zellzählung durch. Setzen Sie die Zellen im Sortierpuffer wieder an. Dies wird die Hauptbevölkerung sein.
Geben Sie einen kleinen Aliquot von 25 bis 50 Mikrolitern in ein separates Röhrchen. Dies wird die untergeordnete Bevölkerung sein. Fügen Sie der Hauptzellpopulation einen konjugierten Anti-NGFR-Antikörper hinzu.
Fügen Sie der kleinen Zellpopulation einen Antikörper zur Isotypkontrolle hinzu. Schützen Sie die Zellen vor Licht und halten Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, Trituieren Sie die Zellen intermittierend, um eine Pelletierung zu verhindern. Fügen Sie nach 30 Minuten den Sortierpuffer zu jedem Zellröhrchen hinzu.
Zentrifugenzellen bei 300 RCF für fünf Minuten. Saugen Sie den Überstand ab, suspendieren Sie die pelletierten Zellen im Sortierpuffer und fügen Sie lebende oder tote Zellflecken hinzu. Sortieren Sie mit einer geeigneten NGFR-positiven Gating-Strategie genügend NGFR-positive Zellen für notwendige nachgelagerte Anwendungen.
Bereiten Sie 6,5 Millimeter poröse Membraneinsätze vor, indem Sie der apikalen Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers eine 200-Mikroliter-Matrix hinzufügen. Stellen Sie es mindestens zwei Stunden vor Bedarf bei 37 Grad Celsius auf. Saugen Sie die Beschichtungsmatrix aus der apikalen Kammer des Einsatzes ab.
Geben Sie 500 Mikroliter des Basalzellmediums in die basolaterale Kammer. Resuspendieren Sie mindestens 30.000 sortierte NGFR-positive Zellen in 100 bis 200 Mikroliter Basalzellmedium und übertragen Sie sie mit einer P200-Mikropipette in die apikale Kammer. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Bohrungen.
Legen Sie die Platte in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator. Aspirieren Sie in zwei bis drei Tagen apikale und basolaterale Kammern und füttern Sie sie mit frischem Basalzellmedium. Überwachen Sie die apikale Kammer täglich mit Lichtmikroskopie.
Wenn die Zellen mehr als 80% Konfluenz erreichen, ersetzen Sie das Basalzellmedium durch ALI-Differenzierungsmedium sowohl in apikalen als auch in basolateralen Kammern. Schützen Sie das ALI-Differenzierungsmedium vor Licht, indem Sie Medienbehälter in Folie eingewickelt aufbewahren und nach Möglichkeit die Deckenleuchten ausschalten. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium aus der apikalen Kammer ab und setzen so die apikale Oberfläche der Luft aus.
Ersetzen Sie die ALI-Differenzierungsmedien in der basolateralen Kammer alle zwei bis drei Tage. Überwachen Sie das Kulturerscheinungsbild alle ein bis zwei Tage. Saugen Sie die angesammelte Flüssigkeit vorsichtig aus der apikalen Kammer ab, ohne die Zellschicht zu stören.
Fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter PBS ohne Kalzium oder Magnesium in die apikale Kammer hinzu, um Ablagerungen oder Schleim zu entfernen. Bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren und dann PBS vorsichtig aspirieren. Beurteilen Sie den TEER auf epitheliale Integrität.
Beobachten Sie nach sieben bis 10 Tagen Luftexposition das Auftreten von Multizilien mit Lichtmikroskopie. Je nach geplantem Experiment und Auslesung können Zellen nach 14 bis 28 Tagen Luftexposition analysiert werden. Nach 10 bis 14 Tagen der letzten 3D-Kulturpassage dissoziieren Sie die Sphäroide zu Einzelzellsuspension, wie zuvor gezeigt.
Führen Sie eine Zellzählung durch, resuspendieren Sie die Zellsuspension in Kryokonservierungsmedium in einem Kryo. Legen Sie Kryofrüchte in einen Behälter, um einen stetigen Temperaturabfall zu gewährleisten. Und Transfer auf minus 80 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden, gefolgt von Transfer auf minus 150 Grad Celsius für die Langzeitlagerung.
Mit dieser Gating-Technik waren 28% der lebenden Einzelzellen NGFR-positiv. Nach zwei Tagen waren einzelne Zellen zunächst leicht identifizierbar und hatten ein längliches spindelförmiges Aussehen. Nach zwei weiteren Tagen bildeten die Zellen eine konfluierende und lose gepackte Monoschicht.
In den folgenden Tagen bis Wochen bildeten die Zellen eine dicht gepackte, hochzelluläre Epithelschicht. Und nach sieben bis 10 Tagen gab es ein klares Aufkommen von schlagenden Zilien und Schleimproduktion. Der TEER der Proben wurde gemessen und die Ergebnisse ähnelten Messungen von primären Atemwegsepithelzellen-Kontrollproben.
Eine anschließende Fixierung mit paraformem Aldehyd und Immunmarkierung für kanonische Atemwegsepithelzellmarker wurde unter anderem für MUC5AC und acetyliertes Alpha-Tubulin durchgeführt. Nach diesem Protokoll können Forscher eine große Anzahl von von Patienten abgeleiteten Epithelzellkulturen der Atemwege erzeugen, um verschiedene Auslesungen zu bewerten, einschließlich solcher, die die Funktionen von basalen, sekretorischen und vermehrten Zellen sowohl bei Krankheit als auch bei Gesundheit testen.
