פרוטוקול זה מועיל מכיוון שהוא מספק צעדים קלים לביצוע המאפשרים יצירת תאי אפיתל תפקודיים של דרכי הנשימה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי לחקור היבטים שונים של הביולוגיה של דרכי הנשימה. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא היכולת לייצר תרביות תאי אפיתל תפקודיות רבות של דרכי הנשימה, ובמקביל להימנע מהקשיים בהשגה ובעיבוד של תאי אוויר ראשוניים. מי שידגים את ההליך יהיה טיילור מאט, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלנו.
התחילו בהפשרת נפח מספיק של מטריצה תלת-ממדית על קרח. שמור אותו על קרח עד שיהיה מוכן לשימוש. להפשיר בקבוקון של תרחיפים חד-תאיים של תאי iBC שהושרו בעבר בהקפאה על ידי דגירה שלו באמבט מים או חרוזים של 37 מעלות צלזיוס עד שאין מדיה קפואה נראית לעין.
באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף שישה עד 10 מיליליטרים של DMEM/F12 באופן טיפתי למתלה התא. ערבבו בעדינות וצנטריפוגה ב-300 RCF במשך חמש דקות כדי להעיף את התאים.
שאפו את הסופרנטנט והחזירו את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום תאי הבסיס עם מיקרופיפט P1000. מכינים 10 אליקוטים של מיקרוליטר ומבצעים ספירת תאים. צנטריפוגה של התאים ב-300 RCF למשך חמש דקות.
לשאוף את הסופרנטנט ולהחיות את התאים בצפיפות של 4, 000 תאים לכל מיקרוליטר במטריצה שהופשרה בעבר במטריצה תלת-ממדית עם מיקרופיפט P1000. עם מיקרופיפט P200, הוסף טיפה של תמיסת המטריצה המתאימה לכ-25 עד 50 מיקרוליטרים לבסיס של כל באר של צלחת שטופלה בתרבית רקמה של 12 בארות. דגירה של הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות.
לאחר מכן הוסיפו מספיק מדיום של תאי בסיס לכל באר כדי להטביע את הטיפה במלואה באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר. מחזירים את הצלחת לחממה לחה. תאי הזנה כל יומיים באמצעות מדיום תאי בסיס טריים.
מוסיפים מדיום טרי לצד הבאר עם פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, תוך הקפדה שלא להפריע לטיפות התאים. להפשיר נפח מספיק של מטריצת התלת-ממד על הקרח. שמור אותו על קרח עד שיהיה מוכן לשימוש.
לאחר כחמישה עד שבעה ימים של דגירה של לוחות תרבית, שאפו את המדיום מכל באר, ולאחר מכן השתמשו במיקרופיפט P1000, הוסיפו מיליליטר אחד של dispase II ישירות על הספרואידים כדי להתנתק מהטיפה של המטריצה. מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. באמצעות מיקרופיפט P1000, ערבבו את הדיספוזה על ידי צנרת למעלה ולמטה פעמיים, תוך שבירת גושים גדולים של המטריצה התלת-ממדית.
מחזירים את הלוח ל-37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 40 דקות נוספות, מה שמאפשר למטריצה להתמוסס לחלוטין. כאשר הטיפות של המטריצה התלת-ממדית אינן נראות עוד מתחת למיקרוסקופ האור, הוסיפו את הספרואידים הצפים בחופשיות לצינור חרוטי של 15 מיליליטר באמצעות קצה פיפטה סרולוגי של חמישה מיליליטר. הוסף DMEM/F12 לנפח סופי של 10 מיליליטרים לכל צינור חרוטי וצנטריפוגה ב-200 RCF למשך שלוש דקות כדי לכדור את הספרואידים.
שאפו לסופרנאטנט והוסיפו מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין לכל טיפה ראשונית המנותקת. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ותשלו אותה כל שתיים-שלוש דקות. הערך את הפתרון באמצעות מיקרוסקופ האור כל כמה דקות.
כאשר יותר מ-90% מהספרואידים נותקו לתאים בודדים, הוסיפו 10% סרום בקר עוברי לטריפסין. מסננים את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב-300 RCF למשך חמש דקות. בצע ספירת תאים ובצע החייאה שווה של התאים בצפיפות של 400 תאים לכל מיקרוליטר של מטריצה תלת-ממדית מופשרת.
הימנעו מהכנסת בועות אוויר. יש לבצע שימוש חוזר במספר הטיפות הדרושות ליישום במורד הזרם. חזור על תהליך זה עבור כל באר.
לאחר 10 עד 14 ימים של המעבר האחרון, נתקו את הספרואידים לתרחיף של תא בודד כפי שהוכח קודם לכן ובצעו ספירת תאים. בצעו שימוש חוזר בתאים במאגר מיון. זו תהיה האוכלוסייה העיקרית.
מעבירים אליקווט קטן של 25 עד 50 מיקרוליטרים לצינור נפרד. זו תהיה האוכלוסייה הקטנה. הוסף נוגדן מצומד נגד NGFR לאוכלוסיית התאים העיקרית.
הוסף נוגדן לבקרת איזוטיפ לאוכלוסיית התאים הקטנים. הגנו על התאים מפני אור והשאירו אותם על הקרח במשך 30 דקות לסירוגין טריטורציה של התאים כדי למנוע את התפשטות הכדורים. לאחר 30 דקות, הוסף את מאגר המיון לכל צינור של תאים.
תאי צנטריפוגה ב-300 RCF למשך חמש דקות. לשאוף את הסופרנטנט, להחיות את התאים הכדוריים במאגר המיון ולהוסיף כתם תאים חיים או מתים. באמצעות אסטרטגיית גידור חיובית מתאימה של NGFR, מיין מספיק תאים חיוביים של NGFR עבור יישומים נחוצים במורד הזרם.
הכן תוספות ממברנה נקבובית של 6.5 מילימטר על ידי הוספת מטריצה של 200 מיקרוליטר לתא האפי לפי הוראת היצרן. מניחים אותו על 37 מעלות צלזיוס לפחות שעתיים לפני הצורך. שאפו את מטריצת הציפוי מהתא האפיקלי של התוספת.
הוסף 500 מיקרוליטרים של מדיום תא הבסיס לתא הבזולטרלי. יש לבצע החייאה של לפחות 30, 000 תאים חיוביים של NGFR ממוינים ב-100 עד 200 מיקרוליטרים של תא בסיס מדיום ולהעביר לתא האפיקלי באמצעות מיקרופיפט P200. חזור על הבארות הנותרות.
מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס. תוך יומיים-שלושה, שאפו לתאים אפיים ובזולטראליים והזינו עם מדיום תאי בסיס טריים. נטר את תא האפיקל מדי יום באמצעות מיקרוסקופיית אור.
כאשר התאים מגיעים ליותר מ-80% מפגש, החליפו את מדיום תאי הבסיס במדיום התמיינות ALI הן בתאים האפיים והן בתאים הבזולטרליים. הגן על מדיום ההבחנה ALI מפני אור על ידי שמירה על מיכלי מדיה עטופים בנייר כסף ועל ידי כיבוי אורות תקורה במידת האפשר. למחרת, שאפו את המדיום מהתא האפיקלי, ובכך חשפו את פני השטח האפיים לאוויר.
החלף את מדיית ההבחנה של ALI בתא הבזולטרלי כל יומיים-שלושה. עקוב אחר מראה התרבות כל יום עד יומיים. יש לשאוף בזהירות לכל נוזל שהצטבר מהתא האפיקלי מבלי להפריע לשכבת התא.
מוסיפים בעדינות 100 מיקרוליטרים של PBS ללא סידן או מגנזיום לתא האפי כדי להסיר פסולת או ריר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן לשאוף בזהירות PBS. הערך את ה- TEER עבור שלמות אפיתל.
לאחר שבעה עד 10 ימים של חשיפה לאוויר, יש להתבונן בהופעת מולטיציליה באמצעות מיקרוסקופיית אור. בהתאם לניסוי המתוכנן ולקריאה, ניתן לנתח תאים לאחר 14 עד 28 ימים של חשיפה לאוויר. לאחר 10 עד 14 ימים של מעבר התרבית התלת-ממדית האחרון, נתקו את הספרואידים לתרחיף של תאים בודדים כפי שהוכח קודם לכן.
לבצע ספירת תאים, להחיות את ההשעיה של התא במדיום שימור בהקפאה בקריוביאל. מניחים קריוביאלים במיכל כדי להבטיח ירידה מתמדת בטמפרטורה. והעברה למינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות ולאחר מכן העברה למינוס 150 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
בעזרת טכניקת גידור זו, 28% מהתאים הבודדים החיים היו חיוביים ל-NGFR. לאחר יומיים, תאים בודדים היו ניתנים לזיהוי בקלות בקלות והיה להם מראה מוארך בצורת ציר. לאחר יומיים נוספים, התאים יצרו חד-שכבתית משולבת וארוזה באופן רופף.
בימים עד שבועות שלאחר מכן, התאים יצרו שכבת אפיתל תאית צפופה ודחוסה מאוד. ואחרי שבעה עד עשרה ימים, הייתה הופעה ברורה של הכאת ריסונים וייצור ריר. ה-TEER של הדגימות נמדד והתוצאות היו דומות למדידות של דגימות בקרת תאי אפיתל ראשוניות של דרכי הנשימה.
קיבוע מאוחר יותר עם אלדהיד פרפורמי ואימונו-לתיוג עבור סמני תאי אפיתל של דרכי הנשימה הקנוניים בוצע עבור MUC5AC ואצטילציה אלפא-טובולין בין היתר. בעקבות פרוטוקול זה, חוקרים יכולים ליצור מספר רב של תרביות תאי אפיתל של דרכי הנשימה שמקורן בחולה כדי להעריך קריאות שונות, כולל אלה שבודקות את הפונקציות של תאים בסיסיים, מפרישים ורב-תאיים הן במחלות והן בבריאות.
