Этот протокол полезен, потому что он обеспечивает простые в выполнении шаги, которые позволяют генерировать функциональные эпителиальные клетки дыхательных путей, которые затем могут быть использованы для изучения различных аспектов биологии дыхательных путей. Основным преимуществом этого протокола является способность генерировать множество функциональных культур эпителиальных клеток дыхательных путей, одновременно избегая трудностей получения и культивирования первичных клеток дыхательных путей. Продемонстрировать процедуру будет Тейлор Матте, аспирант нашей лаборатории.
Начните с размораживания достаточного объема 3D матрицы на льду. Держите его на льду до готовности к использованию. Разморозьте флакон с ранее криоконсервированными одноклеточными суспензиями iBC, инкубируя его в воде или бисерной ванне с температурой 37 градусов Цельсия, пока не появятся видимые замороженные среды.
Используя пятимиллилитровую серологическую пипетку, перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте от шести до 10 миллилитров DMEM/F12 по каплям в клеточную суспензию. Аккуратно перемешайте и центрифугируйте при 300 RCF в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки.
Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу в одном миллилитре базально-клеточной среды с помощью микропипетки P1000. Подготовьте 10-микролитровую аликвоту и выполните подсчет клеток. Центрифугируйте клетки при 300 RCF в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки с плотностью 4000 клеток на микролитр в ранее размороженной на 3D матрице с помощью микропипетки P1000. С помощью микропипетки P200 добавьте каплю матричного раствора, соответствующую приблизительно 25-50 микролитрам, к основанию каждой лунки 12-луночной пластины, обработанной культурой ткани. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно 15 минут.
Затем добавьте достаточно базальноклеточной среды в каждую лунку, чтобы полностью погрузить каплю, используя пятимиллилитровую серологическую пипетку. Верните тарелку в увлажненный инкубатор. Подкармливайте клетки каждые два дня, используя свежую базальную среду.
Добавьте свежую среду в боковую часть лунки пятимиллилитровой серологической пипеткой, следя за тем, чтобы не потревожить капли клеток. Разморозьте достаточный объем 3D матрицы на льду. Держите его на льду до готовности к использованию.
Примерно через пять-семь дней инкубации культуральных пластинок аспирируют среду из каждой лунки, затем, используя микропипетку P1000, добавляют один миллилитр диспазы II непосредственно на сфероиды, чтобы диссоциировать от капли матрицы. Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 10-15 минут. Используя микропипетку P1000, смешайте диспазу, дважды пипетируя вверх и вниз, разбивая большие сгустки 3D-матрицы.
Верните пластину к 37 градусам Цельсия еще на 30-40 минут, позволив матрице полностью раствориться. Когда капля 3D-матрицы больше не будет видна под световым микроскопом, добавьте свободно плавающие сфероиды в коническую трубку объемом 15 миллилитров с помощью пятимиллилитрового серологического наконечника пипетки. Добавьте DMEM/F12 для окончательного объема 10 миллилитров на коническую трубку и центрифугу при 200 RCF в течение трех минут, чтобы гранулировать сфероиды.
Аспирировать супернатант и добавить один миллилитр 0,05% трипсина на каждую начальную диссоциированную каплю. Инкубируют при температуре 37 градусов по Цельсию, протирая ее каждые две-три минуты. Оценивайте раствор с помощью светового микроскопа каждые несколько минут.
Когда более 90% сфероидов были диссоциированы на отдельные клетки, добавьте 10% фетальной бычьей сыворотки к трипсину. Фильтруйте ячейки через 40-микрометровый сетчатый фильтр и центрифугу при 300 RCF в течение пяти минут. Выполните подсчет клеток и равномерно повторно суспендируйте ячейки при плотности 400 клеток на микролитр размороженной 3D-матрицы.
Избегайте введения пузырьков воздуха. Повторно суспендируйте столько капель, сколько необходимо для последующего применения. Повторите этот процесс для каждой скважины.
Через 10-14 дней после последнего прохождения диссоциируют сфероиды на одноклеточную суспензию, как было продемонстрировано ранее, и выполните подсчет клеток. Повторное суспендирование ячеек в буфере сортировки. Это будет основное население.
Переложите небольшую аликвоту от 25 до 50 микролитров на отдельную трубку. Это будет незначительное население. Добавьте конъюгированное анти-NGFR антитело к основной клеточной популяции.
Добавьте контрольные антитела изотипа к популяции второстепенных клеток. Защитите клетки от света и держите их на льду в течение 30 минут, периодически обтирайте клетки, чтобы предотвратить гранулирование. Через 30 минут добавьте буфер сортировки к каждой пробирке клеток.
Центрифужные ячейки при 300 RCF в течение пяти минут. Аспирируйте супернатант, повторно суспендируйте гранулированные клетки в буфере сортировки и добавьте окрашивание живых или мертвых клеток. Используя соответствующую стратегию положительного гатирования NGFR, отсортируйте достаточное количество положительных клеток NGFR для необходимых последующих применений.
Подготовьте 6,5-миллиметровые пористые мембранные вставки, добавив 200-микролитровую матрицу в апикальную камеру в соответствии с инструкцией производителя. Поместите его при температуре 37 градусов по Цельсию не менее чем за два часа до необходимости. Аспирируйте матрицу покрытия из апикальной камеры вставки.
Добавьте 500 микролитров базальной клеточной среды в базолатеральную камеру. Повторно суспендировать, по меньшей мере, 30 000 отсортированных NGFR-положительных клеток в 100-200 микролитрах базальной клеточной среды и перенести в апикальную камеру с использованием микропипетки P200. Повторите для остальных скважин.
Поместите пластину в увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия. Через два-три дня аспирируют аспиральную и базолатеральную камеры и питают свежей базально-клеточной средой. Ежедневно контролируйте апикальную камеру с помощью световой микроскопии.
Когда клетки достигнут более 80% слияния, замените базально-клеточную среду средой дифференцировки ALI как в апикальной, так и в базолатеральной камерах. Защитите дифференциационную среду ALI от света, удерживая контейнеры для носителей, обернутые в фольгу, и выключая верхний свет, когда это возможно. На следующий день аспирируйте среду из апикальной камеры, тем самым подвергая апикальную поверхность воздействию воздуха.
Заменяйте дифференцирующие среды ALI в базолатеральной камере каждые два-три дня. Отслеживайте внешний вид языка и региональных параметров каждые один-два дня. Осторожно аспирируйте любую скопившуюся жидкость из апикальной камеры, не нарушая клеточный слой.
Осторожно добавьте 100 микролитров PBS без кальция или магния в апикальную камеру, чтобы удалить мусор или слизь. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем тщательно аспирируйте PBS. Оцените TEER на целостность эпителия.
После семи-10 дней воздействия воздуха наблюдайте за появлением мультицилий с помощью световой микроскопии. В зависимости от запланированного эксперимента и показаний, клетки могут быть проанализированы после 14-28 дней воздействия воздуха. Через 10-14 дней после последнего прохождения 3D-культуры диссоциируют сфероиды на одноклеточную суспензию, как было показано ранее.
Выполняют подсчет клеток, повторно суспендируют клеточную суспензию в криоконсервационной среде в криовиальной. Поместите криовиалы в контейнер, чтобы обеспечить устойчивое падение температуры. И переложить до минус 80 градусов Цельсия на 24-48 часов с последующим переносом до минус 150 градусов Цельсия для длительного хранения.
С помощью этой техники 28% живых одиночных клеток были положительными NGFR. Через два дня отдельные клетки были первоначально легко идентифицируемы и имели удлиненный веретенообразный вид. Еще через два дня клетки образовали сливающийся и неплотно упакованный монослой.
В течение последующих дней или недель клетки образовывали плотно упакованный, высококлеточный эпителиальный слой. А через семь-10 дней наблюдалось явное появление биения ресничек и выработки слизи. TEER образцов был измерен, и результаты были аналогичны измерениям первичных образцов эпителиальных клеток дыхательных путей.
Последующая фиксация параформным альдегидом и иммуномаркировка для канонических маркеров эпителиальных клеток дыхательных путей была выполнена для MUC5AC и ацетилированного альфа-тубулина среди других. Следуя этому протоколу, исследователи могут генерировать большое количество культур эпителиальных клеток дыхательных путей, полученных от пациента, для оценки различных показаний, в том числе тех, которые проверяют функции базальных, секреторных и мультицилиализированных клеток как в заболевании, так и в здоровье.
