Este protocolo es útil porque proporciona pasos fáciles de seguir que permiten la generación de células epiteliales funcionales de las vías respiratorias, que luego se pueden utilizar para estudiar varios aspectos de la biología de las vías respiratorias. La principal ventaja de este protocolo es la capacidad de generar muchos cultivos funcionales de células epiteliales de las vías respiratorias y, al mismo tiempo, evitar las dificultades de obtener y cultivar células primarias de las vías respiratorias. Demostrando el procedimiento estará Taylor Matte, un estudiante graduado de nuestro laboratorio.
Comience por descongelar un volumen suficiente de matriz 3D en hielo. Manténgalo en hielo hasta que esté listo para su uso. Descongele un vial de suspensiones unicelulares de iBC previamente criopreservadas incubándolo en un baño de agua o perlas de 37 grados Celsius hasta que no haya medios congelados visibles.
Usando una pipeta serológica de cinco mililitros, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue de seis a 10 mililitros de DMEM/F12 gota a gota a la suspensión celular. Mezcle suavemente y centrifugue a 300 RCF durante cinco minutos para granular las células.
Aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en un mililitro de Basal Cell Medium con una micropipeta P1000. Prepare una alícuota de 10 microlitros y realice un recuento de células. Centrifugar las células a 300 RCF durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante y resuspendir las células a una densidad de 4.000 células por microlitro en la matriz previamente descongelada a 3D con una micropipeta P1000. Con una micropipeta P200, agregue una gota de la solución de matriz correspondiente a aproximadamente 25 a 50 microlitros a la base de cada pocillo de una placa tratada con cultivo de tejido de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante aproximadamente 15 minutos.
Luego agregue suficiente medio de células basales a cada pozo para sumergir completamente la gota usando una pipeta serológica de cinco mililitros. Devuelva la placa a una incubadora humidificada. Alimentar las células cada dos días utilizando un medio de células basales fresco.
Agregue el medio fresco al costado del pozo con una pipeta serológica de cinco mililitros, teniendo cuidado de no perturbar la gota de células. Descongelar un volumen suficiente de la matriz 3D sobre hielo. Manténgalo en hielo hasta que esté listo para su uso.
Después de aproximadamente cinco a siete días de incubación de placas de cultivo, aspire el medio de cada pozo, luego use una micropipeta P1000, agregue un mililitro de dispasa II directamente sobre los esferoides para disociarse de la gota de la matriz. Coloque la placa en una incubadora de 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Usando una micropipeta P1000, mezcle la dispasa mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo dos veces, rompiendo grandes grupos de la matriz 3D.
Devuelva la placa a 37 grados Celsius durante 30 a 40 minutos adicionales, permitiendo que la matriz se disuelva por completo. Cuando la gota de la matriz 3D ya no sea visible bajo el microscopio de luz, agregue los esferoides que flotan libremente a un tubo cónico de 15 mililitros usando una punta de pipeta serológica de cinco mililitros. Agregue DMEM/ F12 para un volumen final de 10 mililitros por tubo cónico y centrífuga a 200 RCF durante tres minutos para granular los esferoides.
Aspire el sobrenadante y agregue un mililitro de tripsina al 0,05% por cada gota inicial disociada. Incubar a 37 grados centígrados, triturándolo cada dos o tres minutos. Evalúe la solución con el microscopio de luz cada pocos minutos.
Cuando más del 90% de los esferoides se hayan disociado a células individuales, agregue un 10% de suero bovino fetal a la tripsina. Filtre las células a través de un colador celular de 40 micrómetros y centrífuga a 300 RCF durante cinco minutos. Realice un recuento de células y resuspenda uniformemente las células a una densidad de 400 células por microlitro de matriz 3D descongelada.
Evite introducir burbujas de aire. Resusponga tantas gotas como sea necesario para la aplicación posterior. Repita este proceso para cada pozo.
Después de 10 a 14 días del paso más reciente, disociar los esferoides a una suspensión de una sola célula como se demostró anteriormente y realizar un recuento de células. Vuelva a suspender las celdas en el búfer de ordenación. Esta será la población principal.
Transfiera una pequeña alícuota de 25 a 50 microlitros a un tubo separado. Esta será la población menor. Añadir anticuerpos anti-NGFR conjugados a la población celular principal.
Agregue anticuerpos de control de isotipos a la población de células menores. Proteja las células de la luz y manténgalas en hielo durante 30 minutos de forma intermitente Tritura las células para evitar la peletización. Después de 30 minutos, agregue el tampón de clasificación a cada tubo de celdas.
Centrífugas a 300 RCF durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante, vuelva a suspender las células peletizadas en el tampón de clasificación y agregue la mancha de células vivas o muertas. Utilizando una estrategia apropiada de gating positivo NGFR, clasifique suficientes células NGFR positivas para las aplicaciones posteriores necesarias.
Prepare insertos de membrana porosa de 6,5 milímetros agregando una matriz de 200 microlitros a la cámara apical según las instrucciones del fabricante. Colóquelo a 37 grados centígrados durante al menos dos horas antes de que sea necesario. Aspire la matriz de recubrimiento desde la cámara apical del inserto.
Agregue 500 microlitros del medio de células basales a la cámara basolateral. Resuspendiera al menos 30,000 células NGFR positivas clasificadas en 100 a 200 microlitros Basal Cell Medium y transfiéralas a la cámara apical usando una micropipeta P200. Repita para los pozos restantes.
Coloque la placa en una incubadora humidificada de 37 grados centígrados. En dos o tres días, aspire las cámaras apical y basolateral y alimente con medio de células basales fresco. Monitoree la cámara apical diariamente con microscopía de luz.
Cuando las células alcancen más del 80% de confluencia, reemplace el medio de células basales con el medio de diferenciación ALI en las cámaras apical y basolateral. Proteja el medio de diferenciación ALI de la luz manteniendo los contenedores de medios envueltos en papel de aluminio y apagando las luces superiores cuando sea posible. Al día siguiente, aspire el medio desde la cámara apical, exponiendo así la superficie apical al aire.
Reemplace los medios de diferenciación ALI en la cámara basolateral cada dos o tres días. Supervise la apariencia del cultivo cada uno o dos días. Aspire cuidadosamente cualquier líquido acumulado de la cámara apical sin perturbar la capa celular.
Agregue suavemente 100 microlitros de PBS sin calcio ni magnesio a la cámara apical para eliminar los desechos o el moco. Incubar a 37 grados Centígrados durante 10 minutos y luego aspirar cuidadosamente PBS. Evaluar el TEER para la integridad epitelial.
Después de siete a 10 días de exposición al aire, observe la aparición de multicilios utilizando microscopía de luz. Dependiendo del experimento planificado y la lectura, las células se pueden analizar después de 14 a 28 días de exposición al aire. Después de 10 a 14 días del paso de cultivo 3D más reciente, disocie los esferoides a la suspensión unicelular como se demostró anteriormente.
Realice un recuento celular, resuspenda la suspensión celular en medio de criopreservación en un criovial. Coloque los crioviales en un recipiente para garantizar una caída constante de la temperatura. Y transfiera a menos 80 grados Celsius durante 24 a 48 horas, seguido de una transferencia a menos 150 grados Celsius para el almacenamiento a largo plazo.
Con esta técnica de gating, el 28% de las células individuales vivas fueron NGFR positivas. Después de dos días, las células individuales eran inicialmente fácilmente identificables y tenían una apariencia alargada en forma de huso. Después de dos días más, las células formaron una monocapa confluente y poco empaquetada.
Durante los días o semanas posteriores, las células formaron una capa epitelial altamente celular apretada. Y después de siete a 10 días, hubo una clara aparición de cilios y producción de moco. Se midió el TEER de las muestras y los resultados fueron similares a las mediciones de las muestras de control de células epiteliales primarias de las vías respiratorias.
La fijación posterior con aldehído paraforme e inmunomarcado para marcadores de células epiteliales canónicas de las vías respiratorias se realizó para MUC5AC y alfa-tubulina acetilada entre otros. Siguiendo este protocolo, los investigadores pueden generar un gran número de cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias derivadas del paciente para evaluar varias lecturas, incluidas las que prueban las funciones de las células basales, secretoras y multiciliadas tanto en la enfermedad como en la salud.
