Ce protocole est utile car il fournit des étapes faciles à suivre qui permettent la génération de cellules épithéliales fonctionnelles des voies respiratoires, qui peuvent ensuite être utilisées pour étudier divers aspects de la biologie des voies respiratoires. Le principal avantage de ce protocole est la capacité de générer de nombreuses cultures cellulaires épithéliales fonctionnelles des voies respiratoires tout en évitant les difficultés d’obtention et de culture des cellules primaires des voies respiratoires. Taylor Matte, un étudiant diplômé de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Commencez par décongeler un volume suffisant de matrice 3D sur la glace. Gardez-le sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Décongeler un flacon de suspensions unicellulaires d’iBC précédemment cryoconservées en l’incubant dans un bain d’eau ou de perles de 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de milieu congelé visible.
À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Ajouter six à 10 millilitres de DMEM/F12 goutte à goutte à la suspension cellulaire. Mélanger doucement et centrifuger à 300 RCF pendant cinq minutes pour granuler les cellules.
Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu cellulaire basal avec une micropipette P1000. Préparez une aliquote de 10 microlitres et effectuez un comptage de cellules. Centrifugez les cellules à 300 RCF pendant cinq minutes.
Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules à une densité de 4 000 cellules par microlitre dans la matrice 3D précédemment décongelée à l’aide d’une micropipette P1000. À l’aide d’une micropipette P200, ajouter une gouttelette de la solution matricielle correspondant à environ 25 à 50 microlitres à la base de chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 12 puits traitée. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant environ 15 minutes.
Ajoutez ensuite suffisamment de milieu basocellulaire à chaque puits pour immerger complètement la gouttelette à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres. Remettez la plaque dans un incubateur humidifié. Cellules alimentaires tous les deux jours en utilisant du milieu basocellulaire frais.
Ajouter le milieu frais sur le côté du puits avec une pipette sérologique de cinq millilitres, en prenant soin de ne pas perturber la gouttelette de cellules. Décongeler un volume suffisant de la matrice 3D sur la glace. Gardez-le sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
Après environ cinq à sept jours d’incubation de plaques de culture, aspirer le milieu de chaque puits, puis à l’aide d’une micropipette P1000, ajouter un millilitre de dispase II directement sur les sphéroïdes pour se dissocier de la gouttelette de la matrice. Placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. À l’aide d’une micropipette P1000, mélangez la dispase en pipetant deux fois de haut en bas, en brisant de gros amas de la matrice 3D.
Remettre la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 à 40 minutes supplémentaires, ce qui permet à la matrice de se dissoudre complètement. Lorsque la gouttelette de la matrice 3D n’est plus visible au microscope optique, ajoutez les sphéroïdes flottant librement à un tube conique de 15 millilitres à l’aide d’une pointe de pipette sérologique de cinq millilitres. Ajouter DMEM/F12 pour un volume final de 10 millilitres par tube conique et centrifuger à 200 RCF pendant trois minutes pour granuler les sphéroïdes.
Aspirer le surnageant et ajouter un millilitre de 0,05% de trypsine pour chaque gouttelette initiale dissociée. Incuber à 37 degrés Celsius, en triturant toutes les deux à trois minutes. Évaluez la solution au microscope optique toutes les quelques minutes.
Lorsque plus de 90% des sphéroïdes ont été dissociés en cellules individuelles, ajoutez 10% de sérum bovin fœtal à la trypsine. Filtrez les cellules à travers une passoire à cellules de 40 micromètres et centrifugez à 300 RCF pendant cinq minutes. Effectuez un comptage de cellules et remettez en suspension uniformément les cellules à une densité de 400 cellules par microlitre de matrice 3D décongelée.
Évitez d’introduire des bulles d’air. Remettez en suspension autant de gouttelettes que nécessaire pour une application en aval. Répétez ce processus pour chaque puits.
Après 10 à 14 jours du passage le plus récent, dissocier les sphéroïdes en une suspension à cellule unique comme démontré précédemment et effectuer un comptage cellulaire. Remettez en suspension les cellules dans le tampon de tri. Ce sera la population principale.
Transférer une petite aliquote de 25 à 50 microlitres dans un tube séparé. Ce sera la population mineure. Ajouter un anticorps anti-NGFR conjugué à la population cellulaire principale.
Ajouter un anticorps de contrôle isotype à la population de cellules mineures. Protégez les cellules de la lumière et gardez-les sur la glace pendant 30 minutes Triturez les cellules par intermittence pour éviter les granules. Après 30 minutes, ajoutez le tampon de tri à chaque tube de cellules.
Centrifuger les cellules à 300 RCF pendant cinq minutes. Aspirer le surnageant, remettre en suspension les cellules granulées dans le tampon de tri et ajouter une tache de cellules vivantes ou mortes. À l’aide d’une stratégie de contrôle positif NGFR appropriée, triez suffisamment de cellules positives NGFR pour les applications en aval nécessaires.
Préparez des inserts de membrane poreuse de 6,5 millimètres en ajoutant une matrice de 200 microlitres à la chambre apicale selon les instructions du fabricant. Placez-le à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures avant d’en avoir besoin. Aspirer la matrice de revêtement de la chambre apicale de l’insert.
Ajouter 500 microlitres du milieu basocellulaire à la chambre basolatérale. Remettre en suspension au moins 30 000 cellules NGFR positives triées dans un milieu cellulaire basal de 100 à 200 microlitres et les transférer dans la chambre apicale à l’aide d’une micropipette P200. Répétez l’opération pour les puits restants.
Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius. En deux à trois jours, aspirez les chambres apicales et basolatérales et nourrissez-les avec du milieu basocellulaire frais. Surveillez quotidiennement la chambre apicale avec la microscopie optique.
Lorsque les cellules atteignent plus de 80% de confluence, remplacez le milieu cellulaire basal par un milieu de différenciation ALI dans les chambres apicales et basolatérales. Protégez le support de différenciation ALI de la lumière en gardant les récipients de médias enveloppés dans du papier d’aluminium et en éteignant les plafonniers lorsque cela est possible. Le lendemain, aspirez le milieu de la chambre apicale, exposant ainsi la surface apicale à l’air.
Remplacer le milieu de différenciation ALI dans la chambre basolatérale tous les deux à trois jours. Surveillez l’apparence de la culture tous les un à deux jours. Aspirer soigneusement tout liquide accumulé de la chambre apicale sans perturber la couche cellulaire.
Ajouter doucement 100 microlitres de PBS sans calcium ni magnésium dans la chambre apicale pour éliminer les débris ou le mucus. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis aspirer soigneusement le PBS. Évaluez le TEER pour l’intégrité épithéliale.
Après sept à 10 jours d’exposition à l’air, observez l’apparition de multicils à l’aide de la microscopie optique. Selon l’expérience et la lecture prévues, les cellules peuvent être analysées après 14 à 28 jours d’exposition à l’air. Après 10 à 14 jours du passage de culture 3D le plus récent, dissociez les sphéroïdes en suspension unicellulaire comme démontré précédemment.
Effectuer un comptage cellulaire, remettre en suspension la suspension cellulaire dans un milieu de cryoconservation dans un cryovial. Placez les cryoviaux dans un récipient pour assurer une baisse constante de la température. Et transférer à moins 80 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures, puis transférer à moins 150 degrés Celsius pour un stockage à long terme.
Avec cette technique de contrôle, 28% des cellules individuelles vivantes étaient positives au NGFR. Après deux jours, les cellules individuelles étaient initialement facilement identifiables et avaient un aspect allongé en forme de fuseau. Après deux jours de plus, les cellules ont formé une monocouche confluente et lâchement emballée.
Au cours des jours ou des semaines qui ont suivi, les cellules ont formé une couche épithéliale étroitement emballée et hautement cellulaire. Et après sept à 10 jours, il y a eu une nette émergence de la production de cils et de mucus. Le TEER des échantillons a été mesuré et les résultats ont été similaires aux mesures des échantillons de contrôle des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires.
Une fixation ultérieure avec de l’aldéhyde paraforme et un immunomarquage pour les marqueurs cellulaires épithéliaux canoniques des voies respiratoires ont été effectués pour le MUC5AC et l’alpha-tubuline acétylée, entre autres. En suivant ce protocole, les chercheurs peuvent générer un grand nombre de cultures de cellules épithéliales des voies respiratoires dérivées du patient pour évaluer diverses lectures, y compris celles qui testent les fonctions des cellules basales, sécrétoires et multiciliées dans la maladie et la santé.
