이 프로토콜은 기능적 기도 상피 세포의 생성을 허용하는 단계를 쉽게 따르기 때문에 유용하며, 이는 기도 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 큰 장점은 많은 기능적 기도 상피 세포 배양물을 생성하는 동시에 일차 기도 세포를 획득하고 배양하는 어려움을 피할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 대학원생 인 테일러 매트 (Taylor Matte)가 될 것입니다.
얼음 위에서 충분한 부피의 3D 매트릭스를 해동하여 시작하십시오. 사용할 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관하십시오. iBCs의 이전에 동결보존된 단일 세포 현탁액의 바이알을 해동시켜 가시적인 동결 배지가 없을 때까지 섭씨 37도 물 또는 비드 욕조에서 배양한다.
5 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 6 ~ 10 밀리리터의 DMEM / F12를 세포 현탁액에 적가하십시오. 세포를 펠릿화하기 위해 5분 동안 300 RCF에서 5분 동안 부드럽게 혼합하고 원심분리한다.
상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 P1000 마이크로피펫으로 1밀리리터의 기초 세포 배지에 재현탁시킨다. 10 마이크로리터 분취량을 준비하고 세포 계수를 수행한다. 세포를 5분 동안 300 RCF에서 원심분리한다.
상청액을 흡인하고, P1000 마이크로피펫으로 이전에 해동된 3D 매트릭스에서 마이크로리터당 4, 000 세포의 밀도로 세포를 재현탁시킨다. P200 마이크로피펫으로, 대략 25 내지 50 마이크로리터에 해당하는 매트릭스 용액의 액적을 12-웰 조직 배양 처리된 플레이트의 각 웰의 기저부에 첨가한다. 플레이트를 섭씨 37도에서 약 15분 동안 인큐베이션한다.
그런 다음 각 웰에 충분한 기초 세포 배지를 추가하여 다섯 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 액적을 완전히 잠급니다. 플레이트를 가습 인큐베이터로 되돌립니다. 신선한 기초 세포 배지를 사용하여 이틀에 한 번씩 세포를 먹이십시오.
다섯 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 우물 측면에 신선한 배지를 넣고 세포 방울을 방해하지 않도록주의하십시오. 얼음 위에서 충분한 부피의 3D 매트릭스를 해동합니다. 사용할 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
배양 플레이트를 약 5 내지 7일 동안 배양한 후, 각 웰로부터 배지를 흡인한 다음, P1000 마이크로피펫을 사용하여, 1밀리리터의 디스파아제 II를 스페로이드 상에 직접 첨가하여 매트릭스의 액적으로부터 해리시킨다. 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 10 내지 15분 동안 둔다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 디스파제를 두 번 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 3D 매트릭스의 큰 덩어리를 분해합니다.
플레이트를 섭씨 37도까지 추가로 30 ~ 40 분 동안 돌려 매트릭스가 완전히 용해되도록하십시오. 3D 매트릭스의 액적이 광학 현미경으로 더 이상 보이지 않으면 5 밀리리터 혈청 학적 피펫 팁을 사용하여 자유롭게 떠있는 구상체를 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 추가하십시오. DMEM/F12를 원뿔형 튜브 당 10밀리리터의 최종 부피로 첨가하고 200RCF에서 3분 동안 원심분리하여 구상체를 펠릿화합니다.
상청액을 흡인하고 해리 된 모든 초기 물방울에 대해 0.05 % 트립신 한 밀리리터를 첨가하십시오. 섭씨 37도에서 배양하여 두 분에서 세 분마다 분쇄하십시오. 몇 분마다 광학 현미경으로 용액을 평가하십시오.
구상체의 90 % 이상이 단일 세포에 해리되면 트립신에 10 % 태아 소 혈청을 첨가하십시오. 세포를 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과하고 5분 동안 300 RCF에서 원심분리한다. 세포 카운트를 수행하고 해동된 3D 매트릭스의 마이크로리터 당 400 셀의 밀도로 세포를 고르게 재현탁시킨다.
기포가 유입되지 않도록 하십시오. 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 만큼 물방울을 다시 일시 중단합니다. 각 웰에 대해이 과정을 반복하십시오.
가장 최근의 계대 후 10 내지 14일 후, 이전에 입증된 바와 같이 구상체를 단일 세포 현탁액에 해리시키고 세포 계수를 수행한다. 정렬 버퍼에서 셀을 재현탁합니다. 이것은 주요 인구가 될 것입니다.
25 ~ 50 마이크로 리터의 작은 분취량을 별도의 튜브로 옮깁니다. 이것은 소수 인구가 될 것입니다. 컨쥬게이션된 항-NGFR 항체를 주요 세포 집단에 첨가한다.
이소형 대조군 항체를 경미한 세포 집단에 첨가한다. 세포를 빛으로부터 보호하고 30 분 동안 얼음 위에 보관하여 간헐적으로 세포를 트리튜레이트하여 펠릿을 방지하십시오. 30 분 후, 세포의 각 튜브에 정렬 버퍼를 추가하십시오.
세포를 5분 동안 300 RCF에서 원심분리한다. 상청액을 흡인하고, 펠릿화된 세포를 정렬 완충액에 재현탁시키고, 살아있는 또는 죽은 세포 염색을 첨가한다. 적절한 NGFR 포지티브 게이팅 전략을 사용하여 필요한 다운스트림 적용을 위해 충분한 NGFR 양성 셀을 정렬합니다.
제조업체의 지시에 따라 정점 챔버에 200 마이크로리터 매트릭스를 추가하여 6.5mm 다공성 멤브레인 인서트를 준비합니다. 필요하기 전에 적어도 두 시간 동안 섭씨 37도에 두십시오. 코팅 매트릭스를 인서트의 정점 챔버로부터 흡인한다.
500 마이크로 리터의 기저 세포 배지를 기저 측방 챔버에 첨가하십시오. 적어도 30, 000개의 분류된 NGFR 양성 세포를 100 내지 200 마이크로리터의 기저 세포 배지에 재현탁시키고 P200 마이크로피펫을 사용하여 정점 챔버로 옮긴다. 나머지 웰에 대해 반복하십시오.
플레이트를 가습 된 섭씨 37도 인큐베이터에 두십시오. 이틀에서 사흘 안에 정점과 기저측방을 흡인하고 신선한 기저 세포 배지를 먹습니다. 가벼운 현미경으로 매일 정점 챔버를 모니터링하십시오.
세포가 80% 이상의 합류점에 도달하면, 기저 세포 배지를 정점 및 기저 챔버 모두에서 ALI 분화 배지로 대체하십시오. 매체 용기를 호일로 감싸고 가능한 경우 오버 헤드 라이트를 꺼서 빛으로부터 ALI 분화 매체를 보호하십시오. 다음날, 정점 챔버에서 매체를 흡인하여 정점 표면을 공기에 노출시킵니다.
이틀에서 사흘에 한 번씩 기저측성 챔버에서 ALI 분화 배지를 교체한다. 일에서 이틀에 한 번씩 문화권 모양을 모니터링합니다. 세포층을 방해하지 않고 정점 챔버에서 축적 된 액체를 조심스럽게 흡인하십시오.
칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS 100마이크로리터를 정점 챔버에 부드럽게 첨가하여 이물질이나 점액을 제거한다. 섭씨 37도에서 10분 동안 배양한 다음 PBS를 조심스럽게 흡인시킨다. 상피 무결성에 대한 TEER를 평가합니다.
7 ~ 10 일의 공기 노출 후 광 현미경을 사용하여 다섬모의 출현을 관찰하십시오. 계획된 실험 및 판독에 따라, 세포는 공기 노출 후 14 내지 28일 후에 분석될 수 있다. 가장 최근의 3D 배양 계대 후 10 내지 14일 후, 앞서 입증된 바와 같이 구상체를 단일 세포 현탁액에 해리시킨다.
세포 계수를 수행하고, 세포 현탁액을 동결 보존 배지에서 동결 보존에 재현탁시킨다. 온도가 꾸준히 떨어지도록 용기에 냉동 장치를 넣으십시오. 그리고 영하 80도까지 24~48시간 동안 옮긴 후 영하 150°C로 옮겨 장기간 보관한다.
이 게이팅 기술을 사용하면 살아있는 단일 세포의 28 %가 NGFR 양성이었습니다. 이틀 후, 개별 세포는 처음에는 쉽게 식별 할 수 있었고 길쭉한 스핀들 모양의 외관을 가졌습니다. 이틀 후, 세포는 합류하고 느슨하게 패킹된 단일층을 형성하였다.
그 후 며칠에서 몇 주에 걸쳐, 세포는 단단히 포장되고 고도로 세포 상피층을 형성했습니다. 그리고 7 일에서 10 일 후, 섬모와 점액 생산을 때리는 명백한 출현이있었습니다. 샘플의 TEER를 측정하고 결과는 일차 기도 상피 세포 대조군 샘플의 측정과 유사하였다.
파라폼 알데히드를 사용한 후속 고정 및 정준 기도 상피 세포 마커에 대한 면역표지는 MUC5AC 및 아세틸화 알파-튜불린에 대해 수행되었다. 이 프로토콜에 따라 연구자들은 많은 수의 환자 유래기도 상피 세포 배양물을 생성하여 질병과 건강 모두에서 기저, 분비 및 다섬모 세포의 기능을 테스트하는 것을 포함하여 다양한 판독 값을 평가할 수 있습니다.
