هذا البروتوكول فريد من نوعه لأنه يسمح للمستخدم بدراسة وفحص وقياس التفاعل بين الجزيئات القابلة للذوبان والأسطح الكريستالية. دليل قوي على الارتباط الذي لا رجعة فيه للبروتينات المضادة للتجمد بالجليد أو تم الحصول عليه باستخدام هذه الطريقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على التحكم في نمو الجليد بحجم ميكرون وبلورات الترطيب وتبادل المحلول حولها بطريقة خاضعة للرقابة.
للبدء ، ضع القالب المعد مسبقا في طبق بتري زجاجي مغطى بورق الألومنيوم. ثم قم بتحضير 30 إلى 40 ملليلتر من خليط PDMS عن طريق وزن 1 إلى 10 خليط من عامل المعالجة والمطاط الصناعي والخلط المستمر لمدة خمس دقائق تقريبا حتى يظهر الخليط أبيض وغير شفاف تقريبا. بعد ذلك ، صب خليط PDMS في طبق بتري مع القالب و degas في مجفف حتى لا تبقى فقاعات.
اخبز القالب مع PDMS السائل في فرن أو على صفيحة ساخنة عند 70 درجة مئوية حتى يتم الحصول على اتساق يشبه المطاط. ثم قم بقطع الجهاز عن طريق تتبع الميزات باستخدام مشرط ، مع الحرص على المضي قدما باستخدام المشرط بدلا من الأسفل ، لأن القالب هش. بعد إزالة جهاز PDMS المقطوع ، ضعه رأسا على عقب في طبق بتري جديد.
باستخدام حقنة حادة ، إبرة قياس 20 ، قم بثقب الثقوب في الجهاز بناء على النمط المطبوع. ثم أدخل PDMS الذي تم تنظيفه والغطاء في منظف البلازما. أغلق الصمامات وقم بتشغيل الطاقة والتفريغ والمضخة.
اترك منظف البلازما يعمل لمدة دقيقة تقريبا. اضبط الترددات اللاسلكية على ارتفاع عال واسمح لبعض الهواء بدخول منظف البلازما باستخدام الصمام الدقيق. عندما يتغير لون نوافذ العرض من اللون الأرجواني إلى الوردي، دع منظف البلازما يعمل لمدة 50 ثانية لإيقاف تشغيل الترددات اللاسلكية.
حافظ على تشغيل المضخة لمدة دقيقة ، وبعد إيقاف تشغيلها ، افتح الصمام الرئيسي تدريجيا للسماح للهواء بالدخول إلى منظف البلازما. ثم اضغط على سطح PDMS على الغطاء النظيف وتأكد من أنها مرتبطة من خلال عدم ملاحظة أي انفصال عند سحبها قليلا على الغطاء العلوي. بعد تثبيت إبرة إبرة حادة 90 درجة مع زوج من الكماشة ، أدخل أحد طرفي الإبرة في أنبوب Tygon والطرف الآخر في أحد الثقوب المثقوبة في الجهاز أثناء تكرار العملية للثقوب الأخرى.
ضع كمية صغيرة من زيت الغمر على سطح المرحلة الباردة النحاسية وانشرها باستخدام منديل خال من الوبر لإنشاء طبقة رقيقة من الزيت. بعد ذلك ، ضع قرص ياقوتي نظيف على طبقة الزيت التي تم إنشاؤها. ثم ضع قطرة من زيت الغمر على وسط قرص الياقوت وضع جهاز PDMS على الأسفل بحيث يتم محاذاة ميزات الجهاز فوق فتحة الرؤية في المرحلة الباردة.
بعد تثبيت الجهاز في مكانه ، قم بتأمين الأنابيب على الجدران الخارجية لصندوق الألومنيوم الذي يضم الشريط اللاصق. باستخدام حقنة زجاجية ، حقن أربعة إلى خمسة ميكرولترات من محلول البروتين المضاد للتجمد في قناة المدخل وأغلق غطاء المرحلة الباردة. ابدأ برنامج التحكم في درجة الحرارة واضبط درجة الحرارة على 25 درجة مئوية تحت الصفر.
ثم قم بزيادة درجة الحرارة ببطء بمقدار درجة مئوية واحدة تقريبا لكل خمس ثوان. اقترب من نقطة انصهار العينات ، والتي يمكن أن تتراوح من ناقص 1 إلى ناقص 0.2 درجة مئوية ، اعتمادا على المخزن المؤقت المستخدم في محلول البروتين المضاد للتجمد. لمراقبة البلورات المفردة بشكل أفضل، قم بالتبديل إلى أهداف 10x أو 20x.
وبعد الحصول على بلورة واحدة في الموقع المطلوب ، قم بزراعة البلورة عن طريق خفض درجة الحرارة قليلا حتى تلتقي نهايات البلورة بجدران القناة. بعد التبديل إلى هدف 50x ، قم بحقن محلول البروتين المضاد للتجمد في القنوات ولاحظ زيادة كثافة التألق ، مما يشير إلى أن محلول البروتين تم حقنه بنجاح في القنوات. لتسجيل عملية تبادل الحلول، استخدم برنامج تصوير عناصر NIS، لضمان عدم ارتفاع الضغط المطبق وحقن المحلول المخزن المؤقت ببطء في المدخل الثاني لجهاز الموائع الدقيقة.
لاحظ انخفاضا في إشارة الفلورسنت بمعدل يعتمد على الضغط المطبق على المحقنة. للحصول على هيدرات THF بعد تحضير محلول ماء THF بنسبة مولية من 1 إلى 15 ، قم بحقن المحلول في جهاز الموائع الدقيقة. بعد تجميد محلول الماء THF ، قم بزيادة درجة الحرارة ببطء حتى يذوب كل الجليد عند استبعاد الهيدرات واحتفظ بدرجة الحرارة عند درجة مئوية واحدة لمدة ثلاث دقائق.
اضبط درجة الحرارة على درجتين مئويتين تحت الصفر ولاحظ وفرة الهيدرات التي تظهر في قنوات الموائع الدقيقة في حالة عدم وجود مثبطات. ثم حقن البروتين المضاد للتجمد أو المثبط في قناة الموائع الدقيقة باستخدام المحقنة الزجاجية أثناء ضبط درجة الحرارة لضمان عدم ذوبان البلورات التي تم الحصول عليها أو نموها والسماح لبضع دقائق لجزيئات المثبط للامتصاص إلى سطح الكريستال. قم بإجراء تبادل المحلول عن طريق حقن المحلول الخالي من المثبطات في القناة.
التقط صورا للبلورة قبل وبعد تبادل المحلول وقم بتحليل شدة التألق على البلورة وفي المحلول باستخدام برنامج التصوير. تم إجراء تبادل ناجح للمحلول حول بلورة ثلجية مما يشير إلى أن تبادل المحلول كان سريعا نسبيا. ومع ذلك ، من الممكن إجراء تبادل أبطأ.
وقد لوحظت بوضوح شدة التألق القادمة من جزيئات البروتينات السكرية المضادة للتجمد الممتزة بالجليد بعد اكتمال التبادل. تم رصد تحليل كمي لتركيز البروتينات المضادة للتجمد وتم تحديد شدة التألق في المحلول وعلى الجليد ، مما يشير إلى انخفاض إشارة التألق في المحلول بعامل 100 أثناء تبادل المحلول ، بينما تظل الإشارة المحسوبة على سطح الجليد ثابتة. تم إجراء تجارب الموائع الدقيقة مع هيدرات THF حيث تم حقن محلول خال من المثبطات في القنوات بعد السماح لبلورات الهيدرات بامتصاص جزيئات المثبطات.
لوحظت هيدرات THF بعد تبادل المحلول مع نوعين من المثبطات ، بما في ذلك البروتينات السكرية المضادة للتجمد الموسومة بإيزوثيوسيانات الفلوريسين و Safranin O ، وهي صبغة فلورسنت. الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء هي تكوين وعزل بلورة واحدة في قنوات الموائع الدقيقة وتبادل المحلول حولها. يمكن استخدام هذه الطريقة مع مواد بلورية أخرى حساسة لدرجة الحرارة العالية ، في محاولة لفهم الآلية التي تتفاعل بها المثبطات مع هذه البلورات.
مهدت القدرة على تبادل المحاليل حول البلورات الطريق للباحثين لتحديد الأفكار الرئيسية في آلية ربط البروتينات المضادة للتجمد واكتشاف ظاهرة جديدة لتأثير النظائر على نمو الجليد.
