Este protocolo é único, pois permite ao usuário estudar, examinar e medir a interação entre moléculas solúveis e superfícies cristalinas. Forte evidência de ligação irreversível de proteínas anticongelantes ao gelo ou obtida usando este método. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de controlar o crescimento de gelo de tamanho mícron e hidratar cristais e trocar a solução em torno deles de forma controlada.
Para começar, coloque o molde pré-preparado em uma placa de Petri de vidro coberta com papel alumínio. Em seguida, prepare 30 a 40 mililitros da mistura PDMS pesando uma mistura de 1 a 10 do agente de cura e do elastômero e misturando continuamente por aproximadamente cinco minutos até que a mistura pareça branca e quase opaca. Em seguida, despeje a mistura PDMS na placa de Petri com o molde e desgaseifique em um exsicador até que não restem bolhas.
Asse o molde com o PDMS líquido em um forno ou em uma placa quente a 70 graus Celsius até obter uma consistência semelhante à borracha. Em seguida, corte o dispositivo traçando as características com um bisturi, tomando o cuidado de empurrar para a frente com o bisturi em vez de para baixo, uma vez que o molde é frágil. Depois de remover o dispositivo PDMS recortado, coloque-o de cabeça para baixo em uma nova placa de Petri.
Usando uma seringa contundente, agulha de calibre 20, faça furos no dispositivo com base no padrão impresso. Em seguida, insira o PDMS limpo e a tampa no limpador de plasma. Feche as válvulas e ligue a energia, o vácuo e a bomba.
Deixe o limpador de plasma funcionar por cerca de um minuto. Defina o RF para alto e permita que um pouco de ar entre no limpador de plasma usando a válvula fina. Quando a cor das janelas de visualização mudar de roxo para rosa, deixe o limpador de plasma trabalhar por 50 segundos para desligar a RF.
Mantenha a bomba ligada por um minuto e, depois de desligá-la, abra gradualmente a válvula principal para permitir que o ar entre no limpador de plasma. Em seguida, pressione a superfície do PDMS na tampa limpa e confirme que eles estão ligados observando que não há descolamento ao puxar ligeiramente para cima no deslizamento da tampa. Depois de fixar a agulha de uma agulha contundente de 90 graus com um par de alicates, insira uma extremidade da agulha em um tubo Tygon e a outra extremidade em um dos orifícios perfurados do dispositivo enquanto repete o processo para os outros furos.
Aplique uma pequena quantidade de óleo de imersão na superfície do estágio frio de cobre e espalhe-o usando um lenço sem fiapos para criar uma fina camada de óleo. Em seguida, coloque o disco de safira limpo na camada de óleo criada. Em seguida, aplique uma gota de óleo de imersão no centro do disco de safira e posicione o dispositivo PDMS na gota de modo que as características do dispositivo estejam alinhadas sobre o orifício de visualização do estágio frio.
Depois de manter o dispositivo no lugar, prenda a tubulação às paredes externas da caixa de alumínio que abriga a fita adesiva. Usando uma seringa de vidro, injete de quatro a cinco microlitros de solução de proteína anticongelante no canal de entrada e feche a tampa do estágio frio. Inicie o programa de controle de temperatura e defina a temperatura para menos 25 graus Celsius.
Em seguida, aumente lentamente a temperatura em aproximadamente um grau Celsius por cinco segundos. Aproxime-se do ponto de fusão das amostras, que pode variar de menos 1 a menos 0,2 grau Celsius, dependendo do tampão usado na solução de proteína anticongelante. Para observar melhor os cristais únicos, mude para objetivos de 10x ou 20x.
E depois de obter um único cristal no local desejado, cresça o cristal diminuindo ligeiramente a temperatura até que as extremidades do cristal encontrem as paredes do canal. Depois de mudar para o objetivo de 50x, injete a solução de proteína anticongelante nos canais e observe o aumento da intensidade de fluorescência, indicando que a solução proteica foi injetada com sucesso nos canais. Para registrar o processo de troca de solução, use o NIS-Elements Imaging Program, garantindo que a pressão aplicada não seja muito alta e injete lentamente a solução tampão na segunda entrada do dispositivo microfluídico.
Observe uma diminuição no sinal fluorescente a uma taxa que depende da pressão aplicada à seringa. Para obter hidratos de THF após a preparação de uma solução de água de THF com uma relação molar de 1 para 15, injete a solução no dispositivo microfluídico. Depois que a solução de água THF estiver congelada, aumente lentamente a temperatura até que todo o gelo tenha derretido com a exclusão dos hidratos e mantenha a temperatura em um grau Celsius por três minutos.
Defina a temperatura para menos dois graus Celsius e observe a abundância de hidratos que aparecem nos canais microfluídicos na ausência de inibidores. Em seguida, injete a proteína anticongelante ou inibidor no canal microfluídico usando a seringa de vidro enquanto ajusta a temperatura para garantir que os cristais obtidos não derretam ou cresçam e permitam alguns minutos para que as moléculas inibidoras adsorvam à superfície do cristal. Efectuar a troca de solução injectando a solução livre de inibidores no canal.
Tire imagens do cristal antes e depois da troca de solução e analise a intensidade de fluorescência no cristal e na solução usando o programa de imagem. Uma troca de solução bem-sucedida em torno de um cristal de gelo foi realizada, indicando que a troca de solução foi relativamente rápida. No entanto, uma troca mais lenta é possível.
A intensidade de fluorescência proveniente das moléculas de glicoproteínas anticongelantes adsorvidas de gelo foi claramente observada após a troca estar completa. Uma análise quantitativa da concentração de proteínas anticongelantes foi monitorada e a intensidade de fluorescência foi determinada na solução e no gelo, indicando que o sinal de fluorescência na solução é diminuído por um fator de 100 durante a troca da solução, enquanto o sinal calculado na superfície do gelo permanece constante. Experimentos microfluídicos com hidratos de THF foram realizados onde uma solução livre de inibidores foi injetada nos canais após os cristais de hidrato serem autorizados a adsorver as moléculas inibidoras.
Os hidratos de THF foram observados após troca de solução com dois tipos de inibidores, incluindo glicoproteínas anticongelantes marcadas com isotiocianato de fluoresceína e Safranin O, um corante fluorescente. As etapas críticas deste procedimento são a formação e isolamento de um único cristal nos canais microfluídicos e a troca de solução em torno dele. Este método pode ser usado com outros materiais cristalinos que são altamente sensíveis à temperatura, em um esforço para entender o mecanismo pelo qual os inibidores interagem com esses cristais.
A capacidade de trocar soluções em torno de cristais abriu o caminho para os pesquisadores identificarem os principais insights sobre o mecanismo de ligação das proteínas anticongelantes e descobrirem um novo fenômeno do efeito isótopo no crescimento do gelo.
