Этот протокол является уникальным, поскольку он позволяет пользователю изучать, исследовать и измерять взаимодействие между растворимыми молекулами и поверхностями кристаллов. Убедительные доказательства необратимого связывания антифризных белков со льдом или получены с помощью этого метода. Основным преимуществом данной методики является возможность контролировать рост микронного размера льда и гидратных кристаллов и контролируемо обмениваться раствором вокруг них.
Для начала поместите предварительно подготовленную форму в стеклянную чашку Петри, покрытую алюминиевой фольгой. Затем приготовьте от 30 до 40 миллилитров смеси PDMS, взвесив от 1 до 10 смеси отверждающего агента и эластомера и непрерывно перемешивая в течение примерно пяти минут, пока смесь не станет белой и почти непрозрачной. Затем вылейте смесь PDMS в чашку Петри с формой и дегазируйте в осушителе, пока не останется пузырьков.
Выпекайте форму с жидкой PDMS в духовке или на конфорке при температуре 70 градусов Цельсия до получения резиноподобной консистенции. Затем вырежьте устройство, проследив вокруг объектов скальпелем, позаботившись о том, чтобы продвинуться вперед скальпелем, а не вниз, так как плесень хрупкая. После снятия вырезанного устройства PDMS поместите его вверх ногами в новую чашку Петри.
Используя тупой шприц, иглу 20 калибра, пробивайте отверстия в устройстве на основе отпечатанного рисунка. Затем вставьте очищенный PDMS и крышку в плазмоочиститель. Закройте клапаны и включите питание, вакуум и насос.
Дайте плазменному очистителю работать около минуты. Установите ВЧ на высокий уровень и позвольте некоторому количеству воздуха войти в плазмоочиститель с помощью тонкого клапана. Когда цвет окон просмотра изменится с фиолетового на розовый, дайте плазменному очистителю поработать в течение 50 секунд, чтобы выключить радиочастоту.
Держите насос включенным в течение минуты, а после его выключения постепенно открывайте главный клапан, чтобы воздух поступал в плазмоочиститель. Затем прижмите поверхность PDMS к очищенному крышке и убедитесь, что они склеены, не наблюдая отслоения при небольшом подтягивании на крышке. После закрепления иглы тупой иглой на 90 градусов с помощью пары плоскогубцев, вставьте один конец иглы в трубку Tygon, а другой конец в одно из выбитых отверстий устройства, повторяя процесс для других отверстий.
Нанесите небольшое количество погружного масла на поверхность медной холодной ступени и распределите его с помощью безворсовой салфетки, чтобы создать тонкий слой масла. Далее поместите чистый сапфировый диск на созданный масляный слой. Затем нанесите каплю погружного масла на центр сапфирового диска и поместите устройство PDMS на каплю таким образом, чтобы особенности устройства были выровнены над смотровым отверстием холодной ступени.
Удерживая устройство на месте, закрепите трубку на внешних стенках алюминиевой коробки, в которой находится клейкая лента. Используя стеклянный шприц, вводят четыре-пять микролитров раствора антифриза белка во входной канал и закрывают крышку холодной стадии. Запустите программу контроля температуры и установите температуру до минус 25 градусов по Цельсию.
Затем медленно увеличивайте температуру примерно на один градус Цельсия за пять секунд. Подойдите к образцам температура плавления, которая может составлять от минус 1 до минус 0,2 градуса Цельсия, в зависимости от буфера, используемого в растворе белка антифриза. Чтобы лучше наблюдать за монокристаллами, переключитесь на 10-кратные или 20-кратные цели.
А после получения монокристалла в нужном месте вырастите кристалл, немного снизив температуру, пока концы кристалла не встретятся со стенками канала. После переключения на объектив 50x вводят раствор белка антифриза в каналы и наблюдают увеличение интенсивности флуоресценции, указывая на то, что белковый раствор был успешно введен в каналы. Чтобы записать процесс обмена раствором, используйте программу ВИЗУАЛИЗАЦИИ NIS-Elements, следя за тем, чтобы приложенное давление не было слишком высоким, и медленно вводите буферный раствор во второе входное отверстие микрофлюидного устройства.
Наблюдают снижение флуоресцентного сигнала со скоростью, которая зависит от давления, приложенного к шприцу. Для получения гидратов ТГФ после приготовления водного раствора ТГФ с молярным соотношением от 1 до 15 вводят раствор в микрофлюидное устройство. После того, как водный раствор THF заморожен, медленно увеличивайте температуру, пока весь лед не растает при исключении гидратов, и удерживайте температуру на уровне одного градуса Цельсия в течение трех минут.
Установите температуру до минус двух градусов Цельсия и наблюдайте за обилием гидратов, которые появляются в микрофлюидных каналах при отсутствии ингибиторов. Затем вводят антифризный белок или ингибитор в микрофлюидный канал с помощью стеклянного шприца, регулируя температуру, чтобы убедиться, что полученные кристаллы не плавятся или не растут, и дайте молекулам ингибитора несколько минут адсорбироваться на поверхности кристалла. Осуществляют обмен раствором путем введения свободного раствора ингибитора в канал.
Сделайте снимки кристалла до и после обмена раствором и проанализируйте интенсивность флуоресценции на кристалле и в растворе с помощью программы визуализации. Был проведен успешный обмен раствором вокруг кристалла льда, что указывает на то, что обмен раствором был относительно быстрым. Однако возможен более медленный обмен.
Интенсивность флуоресценции, исходящей от адсорбированных льдом молекул антифризных гликопротеинов, четко наблюдалась после завершения обмена. Проведен количественный анализ концентрации белков антифриза и определена интенсивность флуоресценции в растворе и на льду, что указывает на то, что сигнал флуоресценции в растворе уменьшается в 100 раз при обмене раствором, в то время как расчетный сигнал на поверхности льда остается постоянным. Проводились микрофлюидные эксперименты с гидратами ТГФ, где в каналы вводили раствор без ингибитора после того, как кристаллам гидратов позволили адсорбировать молекулы ингибитора.
Гидраты ТГФ наблюдались после обмена растворами с двумя типами ингибиторов, включая антифризные гликопротеины, меченные изотиоцианатом флуоресцеина и сафранином О, флуоресцентным красителем. Критическими этапами этой процедуры являются образование и выделение монокристалла в микрофлюидных каналах и обмен раствором вокруг него. Этот метод может быть использован с другими кристаллическими материалами, которые очень чувствительны к температуре, в попытке понять механизм, с помощью которого ингибиторы взаимодействуют с этими кристаллами.
Способность обмениваться растворами вокруг кристаллов проложила путь для исследователей, чтобы определить ключевые идеи в механизме связывания белков антифриза и открыть новое явление изотопного влияния на рост льда.
