이 프로토콜은 사용자가 용해성 분자와 결정 표면 사이의 상호 작용을 연구하고 검사하고 측정 할 수있게 해주는 독특한 원인입니다. 부동액 단백질이 얼음에 비가역적으로 결합하거나 이 방법을 사용하여 얻은 강력한 증거. 이 기술의 주요 장점은 미크론 크기의 얼음의 성장을 제어하고 결정을 수화하고 제어 된 방식으로 주변의 용액을 교환 할 수 있다는 것입니다.
시작하려면 미리 준비된 금형을 알루미늄 호일로 덮인 유리 페트리 접시에 넣으십시오. 그런 다음 경화제와 엘라스토머의 혼합물을 1 내지 10 계량하고 혼합물이 흰색이고 거의 불투명하게 나타날 때까지 약 5분 동안 연속적으로 혼합하여 30 내지 40 밀리리터의 PDMS 혼합물을 준비합니다. 다음으로, PDMS 혼합물을 몰드와 함께 페트리 접시에 붓고 기포가 남지 않을 때까지 데시케이터에서 가스를 제거합니다.
고무 같은 농도가 얻어질 때까지 오븐이나 섭씨 70도의 핫 플레이트에서 액체 PDMS로 금형을 굽습니다. 그런 다음 곰팡이가 깨지기 쉽기 때문에 메스로 피쳐 주위를 추적하여 장치를 잘라냅니다. 컷아웃 PDMS 장치를 제거한 후 새 페트리 접시에 거꾸로 놓습니다.
무딘 주사기, 20 게이지 바늘을 사용하여 각인 된 패턴을 기반으로 장치의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 세척된 PDMS와 커버슬립을 플라즈마 클리너에 삽입합니다. 밸브를 닫고 전원, 진공 및 펌프를 켭니다.
플라즈마 클리너를 약 1분 동안 작동시키십시오. RF를 높게 설정하고 미세 밸브를 사용하여 일부 공기가 플라즈마 클리너로 들어가도록 합니다. 보기 창 색상이 보라색에서 분홍색으로 바뀌면 플라즈마 클리너가 50초 동안 작동하여 RF를 끕니다.
펌프를 잠시 켜두었다가 끈 후 메인 밸브를 서서히 열어 공기가 플라즈마 클리너로 들어갈 수 있도록 합니다. 그런 다음 PDMS 표면을 청소된 커버슬립에 누르고 커버슬립을 약간 위로 당길 때 분리되지 않는 것을 관찰하여 접착되었는지 확인합니다. 한 쌍의 펜치로 90도 무딘 바늘의 바늘을 고정한 후 바늘의 한쪽 끝을 타이곤 튜브에 삽입하고 다른 쪽 끝을 장치의 천공 구멍 중 하나에 삽입하면서 다른 구멍에 대해 이 과정을 반복합니다.
구리 콜드 스테이지의 표면에 소량의 침지 오일을 바르고 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 펴 발라 얇은 오일 층을 만듭니다. 그런 다음 생성 된 오일 층에 깨끗한 사파이어 디스크를 놓습니다. 그런 다음 침지 오일 한 방울을 사파이어 디스크 중앙에 바르고 PDMS 장치를 물방울에 놓아 장치의 기능이 콜드 스테이지의 보기 구멍에 정렬되도록 합니다.
장치를 제자리에 고정한 후 접착 테이프가 있는 알루미늄 상자의 외벽에 튜브를 고정합니다. 유리 주사기를 사용하여 4-5 마이크로 리터의 부동액 단백질 용액을 입구 채널에 주입하고 콜드 스테이지의 뚜껑을 닫습니다. 온도 제어 프로그램을 시작하고 온도를 섭씨 영하 25도로 설정합니다.
그런 다음 5 초마다 약 섭씨 1도 씩 천천히 온도를 올립니다. 부동액 단백질 용액에 사용되는 완충액에 따라 섭씨 영하 1도에서 영하 0.2도 사이의 샘플 융점에 접근하십시오. 단결정을 더 잘 관찰하려면 10x 또는 20x 대물렌즈로 전환하십시오.
그리고 원하는 위치에서 단결정을 얻은 후 결정의 끝이 채널 벽과 만날 때까지 온도를 약간 낮추어 결정을 성장시킵니다. 50x 대물렌즈로 전환한 후 부동액 단백질 용액을 채널에 주입하고 형광 강도 증가를 관찰하여 단백질 용액이 채널에 성공적으로 주입되었음을 나타냅니다. 용액 교환 과정을 기록하려면 NIS-Elements 이미징 프로그램을 사용하여 적용된 압력이 너무 높지 않은지 확인하고 완충 용액을 미세 유체 장치의 두 번째 입구에 천천히 주입하십시오.
주사기에 가해지는 압력에 의존하는 속도로 형광 신호의 감소를 관찰하십시오. THF 수화물을 얻으려면 1 내지 15의 몰비로 THF 수용액을 제조한 후, 용액을 마이크로유체 장치에 주입한다. THF 수용액이 얼린 후 수화물을 제외하고 모든 얼음이 녹을 때까지 천천히 온도를 높이고 온도를 섭씨 1도에서 3분 동안 유지합니다.
온도를 섭씨 영하 2도로 설정하고 억제제가 없을 때 미세 유체 채널에 나타나는 수화물의 풍부함을 관찰하십시오. 그런 다음 유리 주사기를 사용하여 부동액 단백질 또는 억제제를 미세 유체 채널에 주입하면서 온도를 조정하여 얻은 결정이 녹거나 성장하지 않도록하고 억제제 분자가 결정 표면에 흡착 될 때까지 몇 분 동안 허용합니다. 억제제가 없는 용액을 채널에 주입하여 용액 교환을 수행한다.
용액 교환 전후의 결정 이미지를 촬영하고 이미징 프로그램을 사용하여 결정과 용액의 형광 강도를 분석합니다. 얼음 결정 주위의 성공적인 용액 교환이 수행되어 용액 교환이 비교적 빠르다는 것을 나타냅니다. 그러나 더 느린 교환이 가능합니다.
얼음이 흡착된 부동액 당단백질 분자로부터 나오는 형광 강도는 교환이 완료된 후에 명확하게 관찰되었다. 부동액 단백질 농도의 정량 분석을 모니터링하고 용액 및 얼음 위에서 형광 강도를 측정하여 용액 교환 중에 용액의 형광 신호가 100배 감소하는 반면 얼음 표면에서 계산된 신호는 일정하게 유지됨을 나타냅니다. THF 수화물을 사용한 미세 유체 실험은 수화물 결정이 억제제 분자를 흡착하도록 허용 된 후 억제제가없는 용액을 채널에 주입하는 곳에서 수행되었습니다.
THF 수화물은 플루오레세인 이소티오시아네이트 및 형광 염료인 사프라닌 O로 표지된 부동액 당단백질을 포함한 두 가지 유형의 억제제와의 용액 교환 후 관찰되었습니다. 이 절차의 중요한 단계는 미세 유체 채널에서 단결정의 형성 및 분리와 그 주변의 용액 교환입니다. 이 방법은 억제제가 이러한 결정과 상호 작용하는 메커니즘을 이해하기 위해 온도에 매우 민감한 다른 결정 물질과 함께 사용할 수 있습니다.
결정 주위에서 용액을 교환하는 능력은 연구원들이 부동액 단백질의 결합 메커니즘에 대한 주요 통찰력을 식별하고 얼음 성장에 대한 동위원소 효과의 새로운 현상을 발견할 수 있는 길을 열었습니다.
