Dieses Protokoll ist einzigartig, da es dem Benutzer ermöglicht, die Wechselwirkung zwischen löslichen Molekülen und Kristalloberflächen zu untersuchen, zu untersuchen und zu messen. Starke Beweise für eine irreversible Bindung von Frostschutzproteinen an Eis oder erhalten mit dieser Methode. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, das Wachstum von mikrometergroßem Eis zu kontrollieren und Kristalle zu hydratisieren und die Lösung um sie herum kontrolliert auszutauschen.
Um zu beginnen, legen Sie die vorbereitete Form in eine Glas-Petrischale, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist. Bereiten Sie dann 30 bis 40 Milliliter der PDMS-Mischung vor, indem Sie eine 1 bis 10 Mischung aus Härter und Elastomer wiegen und etwa fünf Minuten lang kontinuierlich mischen, bis die Mischung weiß und nahezu undurchsichtig erscheint. Als nächstes gießen Sie die PDMS-Mischung in die Petrischale mit der Form und entgasen in einem Exsikkator, bis keine Blasen mehr übrig sind.
Backen Sie die Form mit dem flüssigen PDMS im Ofen oder auf einer heißen Platte bei 70 Grad Celsius, bis eine gummiartige Konsistenz erhalten ist. Schneiden Sie dann das Gerät aus, indem Sie die Merkmale mit einem Skalpell nachzeichnen, und achten Sie darauf, mit dem Skalpell nach vorne statt nach unten zu drücken, da die Form zerbrechlich ist. Nachdem Sie das ausgeschnittene PDMS-Gerät entfernt haben, legen Sie es kopfüber in eine neue Petrischale.
Mit einer stumpfen Spritze, 20-Gauge-Nadel, stanzen Sie Löcher in das Gerät basierend auf dem aufgedruckten Muster. Führen Sie dann das gereinigte PDMS und das Deckglas in den Plasmareiniger ein. Schließen Sie die Ventile und schalten Sie Strom, Vakuum und Pumpe ein.
Lassen Sie den Plasmareiniger etwa eine Minute laufen. Stellen Sie die HF auf hoch und lassen Sie mit dem Feinventil etwas Luft in den Plasmareiniger eindringen. Wenn sich die Farbe des Sichtfensters von lila zu rosa ändert, lassen Sie den Plasmareiniger 50 Sekunden lang arbeiten, um den RF auszuschalten.
Lassen Sie die Pumpe eine Minute lang eingeschaltet und öffnen Sie nach dem Ausschalten allmählich das Hauptventil, um Luft in den Plasmareiniger zu lassen. Drücken Sie dann die PDMS-Oberfläche auf das gereinigte Deckglas und bestätigen Sie, dass sie verbunden sind, indem Sie beim leichten Hochziehen auf dem Deckglas keine Ablösung beobachten. Nachdem Sie die Nadel einer 90-Grad-Stumpfnadel mit einer Zange gesichert haben, führen Sie ein Ende der Nadel in ein Tygon-Rohr und das andere Ende in eines der ausgestanzten Löcher des Geräts ein, während Sie den Vorgang für die anderen Löcher wiederholen.
Tragen Sie eine kleine Menge Tauchöl auf die Oberfläche der Kupferkaltstufe auf und verteilen Sie es mit einem fusselfreien Wischtuch, um eine dünne Ölschicht zu erzeugen. Als nächstes legen Sie eine saubere Saphirscheibe auf die erzeugte Ölschicht. Tragen Sie dann einen Tropfen Tauchöl auf die Mitte der Saphirscheibe auf und positionieren Sie das PDMS-Gerät so auf dem Tropfen, dass die Merkmale des Geräts über dem Sichtloch der kalten Bühne ausgerichtet sind.
Nachdem Sie das Gerät an Ort und Stelle gehalten haben, befestigen Sie den Schlauch an den Außenwänden der Aluminiumbox, in der sich das Klebeband befindet. Injizieren Sie mit einer Glasspritze vier bis fünf Mikroliter Frostschutzproteinlösung in den Einlasskanal und schließen Sie den Deckel der kalten Stufe. Starten Sie das Temperaturregelprogramm und stellen Sie die Temperatur auf minus 25 Grad Celsius ein.
Dann erhöhen Sie langsam die Temperatur um etwa ein Grad Celsius pro fünf Sekunden. Nähern Sie sich dem Schmelzpunkt der Probe, der je nach Puffer in der Frostschutzproteinlösung zwischen minus 1 und minus 0,2 Grad Celsius liegen kann. Um Einkristalle besser zu beobachten, wechseln Sie zu 10x- oder 20x-Objektiven.
Und nachdem Sie einen Einkristall an der gewünschten Stelle erhalten haben, wachsen Sie den Kristall, indem Sie die Temperatur leicht senken, bis die Enden des Kristalls die Kanalwände treffen. Nach dem Wechsel zum 50x-Objektiv injizieren Sie die Frostschutzproteinlösung in die Kanäle und beobachten Sie die Erhöhung der Fluoreszenzintensität, was darauf hinweist, dass die Proteinlösung erfolgreich in die Kanäle injiziert wurde. Um den Lösungsaustauschprozess aufzuzeichnen, verwenden Sie das NIS-Elements Imaging-Programm, um sicherzustellen, dass der angelegte Druck nicht zu hoch ist, und injizieren Sie die Pufferlösung langsam in den zweiten Einlass des mikrofluidischen Geräts.
Beobachten Sie eine Abnahme des Fluoreszenzsignals mit einer Geschwindigkeit, die vom Druck abhängt, der auf die Spritze ausgeübt wird. Um THF-Hydrate nach Herstellung einer THF-Wasserlösung mit einem molaren Verhältnis von 1 zu 15 zu erhalten, injizieren Sie die Lösung in das mikrofluidische Gerät. Nachdem die THF-Wasserlösung gefroren ist, erhöhen Sie langsam die Temperatur, bis das gesamte Eis unter Ausschluss der Hydrate geschmolzen ist, und halten Sie die Temperatur drei Minuten lang bei einem Grad Celsius.
Stellen Sie die Temperatur auf minus zwei Grad Celsius ein und beobachten Sie die Fülle von Hydraten, die in den mikrofluidischen Kanälen in Abwesenheit von Inhibitoren auftreten. Dann injizieren Sie das Frostschutzprotein oder den Inhibitor mit der Glasspritze in den mikrofluidischen Kanal, während Sie die Temperatur einstellen, um sicherzustellen, dass die erhaltenen Kristalle nicht schmelzen oder wachsen, und lassen Sie den Inhibitormolekülen einige Minuten, um an der Kristalloberfläche zu adsorbieren. Führen Sie den Lösungsaustausch durch, indem Sie die inhibitorfreie Lösung in den Kanal injizieren.
Machen Sie Bilder des Kristalls vor und nach dem Lösungsaustausch und analysieren Sie die Fluoreszenzintensität auf dem Kristall und in der Lösung mit dem Bildgebungsprogramm. Ein erfolgreicher Lösungsaustausch um einen Eiskristall wurde durchgeführt, was darauf hindeutet, dass der Lösungsaustausch relativ schnell war. Ein langsamerer Austausch ist jedoch möglich.
Die Fluoreszenzintensität, die von den eisadsorbierten Frostschutz-Glykoproteinmolekülen ausgeht, wurde nach Abschluss des Austauschs deutlich beobachtet. Eine quantitative Analyse der Frostschutzproteinkonzentration wurde überwacht und die Fluoreszenzintensität in der Lösung und auf dem Eis bestimmt, was darauf hindeutet, dass das Fluoreszenzsignal in der Lösung während des Lösungsaustauschs um den Faktor 100 verringert wird, während das berechnete Signal auf der Eisoberfläche konstant bleibt. Es wurden mikrofluidische Experimente mit THF-Hydraten durchgeführt, bei denen eine inhibitorfreie Lösung in die Kanäle injiziert wurde, nachdem die Hydratkristalle die Inhibitormoleküle adsorbieren durften.
Die THF-Hydrate wurden nach Lösungsaustausch mit zwei Arten von Inhibitoren beobachtet, einschließlich Frostschutzglykoproteinen, die mit Fluoresceinisothiocyanat und Safranin O, einem Fluoreszenzfarbstoff, markiert sind. Die kritischen Schritte dieses Verfahrens sind die Bildung und Isolierung eines Einkristalls in den mikrofluidischen Kanälen und der Austausch der Lösung um ihn herum. Diese Methode kann mit anderen Kristallmaterialien verwendet werden, die sehr temperaturempfindlich sind, um den Mechanismus zu verstehen, durch den Inhibitoren mit diesen Kristallen interagieren.
Die Fähigkeit, Lösungen um Kristalle herum auszutauschen, ebnete den Forschern den Weg, wichtige Einblicke in den Bindungsmechanismus von Frostschutzproteinen zu gewinnen und ein neues Phänomen des Isotopeneffekts auf das Eiswachstum zu entdecken.
