Bu protokol benzersizdir, çünkü kullanıcının çözünür moleküller ve kristal yüzeyler arasındaki etkileşimi incelemesine, incelemesine ve ölçmesine izin verir. Antifriz proteinlerinin buza geri dönüşümsüz bağlanması veya bu yöntem kullanılarak elde edilmesi için güçlü kanıtlar. Bu tekniğin temel avantajı, mikron büyüklüğündeki buzun büyümesini kontrol etme ve kristalleri nemlendirme ve etraflarındaki çözeltiyi kontrollü bir şekilde değiştirme yeteneğidir.
Başlamak için, önceden hazırlanmış kalıbı alüminyum folyo ile kaplı bir cam Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, kürleme maddesi ve elastomerin 1 ila 10 karışımını tartarak ve karışım beyaz ve neredeyse opak görünene kadar yaklaşık beş dakika boyunca sürekli karıştırarak 30 ila 40 mililitre PDMS karışımı hazırlayın. Daha sonra, PDMS karışımını kalıpla Petri kabına dökün ve kabarcık kalmayana kadar bir kurutucuda gazdan arındırın.
Kalıbı sıvı PDMS ile bir fırında veya sıcak plakada kauçuk benzeri bir kıvam elde edilene kadar 70 santigrat derecede pişirin. Ardından, özelliklerin etrafını bir neşterle izleyerek cihazı kesin, kalıp kırılgan olduğu için neşterle aşağı yerine ileriye doğru itmeye özen gösterin. Kesme PDMS cihazını çıkardıktan sonra, yeni bir Petri kabına baş aşağı yerleştirin.
Künt bir şırınga, 20 gauge iğne kullanarak, baskılı desene göre cihazdaki delikleri delin. Ardından temizlenmiş PDMS'yi yerleştirin ve kapak kapağını plazma temizleyiciye yerleştirin. Valfleri kapatın ve gücü, vakumu ve pompayı açın.
Plazma temizleyicinin yaklaşık bir dakika çalışmasına izin verin. RF'yi yükseğe ayarlayın ve ince valfi kullanarak plazma temizleyiciye bir miktar havanın girmesine izin verin. Görüntüleme pencerelerinin rengi mordan pembeye değiştiğinde, RF'yi kapatmak için plazma temizleyicinin 50 saniye çalışmasına izin verin.
Pompayı bir dakika boyunca açık tutun ve kapattıktan sonra, havanın plazma temizleyiciye girmesine izin vermek için ana valfi yavaş yavaş açın. Ardından, PDMS yüzeyini temizlenmiş kapak kayması üzerine bastırın ve kapak kayması üzerinde hafifçe yukarı çekerken ayrılma gözlenmeden yapıştırıldıklarını onaylayın. 90 derecelik künt bir iğnenin iğnesini bir çift pense ile sabitledikten sonra, iğnenin bir ucunu bir Tygon tüpüne ve diğer ucunu cihazın delinmiş deliklerinden birine yerleştirin ve işlemi diğer delikler için tekrarlayın.
Bakır soğuk aşamasının yüzeyine az miktarda daldırma yağı uygulayın ve ince bir yağ tabakası oluşturmak için tüy bırakmayan bir mendil kullanarak yayın. Ardından, oluşturulan yağ tabakasına temiz safir disk yerleştirin. Ardından, safir diskin ortasına bir damla daldırma yağı uygulayın ve PDMS cihazını, cihazın özellikleri soğuk sahnenin görüş deliği üzerinde hizalanacak şekilde damlanın üzerine yerleştirin.
Cihazı yerinde tuttuktan sonra, boruyu yapışkan bandı barındıran alüminyum kutunun dış duvarlarına sabitleyin. Bir cam şırınga kullanarak, giriş kanalına dört ila beş mikrolitre antifriz protein çözeltisi enjekte edin ve soğuk aşamanın kapağını kapatın. Sıcaklık kontrol programını başlatın ve sıcaklığı eksi 25 santigrat dereceye ayarlayın.
Daha sonra sıcaklığı yavaşça beş saniyede yaklaşık bir santigrat derece artırın. Antifriz protein çözeltisinde kullanılan tampona bağlı olarak eksi 1 ila eksi 0,2 santigrat derece arasında değişebilen numunelerin erime noktasına yaklaşın. Tek kristalleri daha iyi gözlemlemek için 10x veya 20x hedeflerine geçin.
İstenilen yerde tek bir kristal elde ettikten sonra, kristalin uçları kanal duvarlarıyla buluşana kadar sıcaklığı hafifçe azaltarak kristali büyütün. 50x hedefine geçtikten sonra, antifriz protein çözeltisini kanallara enjekte edin ve protein çözeltisinin kanallara başarıyla enjekte edildiğini gösteren floresan yoğunluğu artışını gözlemleyin. Çözelti değişim işlemini kaydetmek için, uygulanan basıncın çok yüksek olmadığından emin olmak için NIS-Elements Görüntüleme Programını kullanın ve tampon çözeltisini mikroakışkan cihazın ikinci girişine yavaşça enjekte edin.
Şırıngaya uygulanan basınca bağlı olarak floresan sinyalinde bir azalma gözlemleyin. 1 ila 15 molar oranına sahip bir THF su çözeltisi hazırladıktan sonra THF hidratları elde etmek için, çözeltiyi mikroakışkan cihaza enjekte edin. THF su çözeltisi dondurulduktan sonra, hidratların hariç tutulmasında tüm buzlar eriyene kadar sıcaklığı yavaşça artırın ve sıcaklığı üç dakika boyunca bir santigrat derecede tutun.
Sıcaklığı eksi iki santigrat dereceye ayarlayın ve inhibitörlerin yokluğunda mikroakışkan kanallarda görünen hidratların bolluğunu gözlemleyin. Daha sonra, elde edilen kristallerin erimemesini veya büyümemesini sağlamak için sıcaklığı ayarlarken cam şırıngayı kullanarak antifriz proteinini veya inhibitörünü mikroakışkan kanala enjekte edin ve inhibitör moleküllerinin kristal yüzeyine adsorbe olması için birkaç dakika bekleyin. İnhibitör içermeyen çözeltiyi kanala enjekte ederek çözelti değişimini gerçekleştirin.
Çözelti değişiminden önce ve sonra kristalin görüntülerini alın ve görüntüleme programını kullanarak kristal üzerindeki ve çözeltideki floresan yoğunluğunu analiz edin. Bir buz kristali etrafında başarılı bir çözelti değişimi, çözelti değişiminin nispeten hızlı olduğunu gösteren bir şekilde gerçekleştirildi. Ancak, daha yavaş bir değişim mümkündür.
Buz adsorbe edilmiş antifriz glikoprotein moleküllerinden gelen floresan yoğunluğu, değişim tamamlandıktan sonra açıkça gözlendi. Antifriz proteinleri konsantrasyonunun kantitatif bir analizi izlendi ve çözeltide ve buz üzerinde floresan yoğunluğu belirlendi, bu da çözeltideki floresan sinyalinin çözelti değişimi sırasında 100 kat azaldığını gösterirken, buz yüzeyinde hesaplanan sinyal sabit kaldı. THF hidratları ile mikroakışkan deneyler, hidrat kristallerinin inhibitör molekülleri adsorbe etmesine izin verildikten sonra kanallara inhibitör içermeyen bir çözeltinin enjekte edildiği yerde gerçekleştirildi.
THF hidratları, floresein izotiyosiyanat ile etiketlenmiş antifriz glikoproteinler ve floresan bir boya olan Safranin O dahil olmak üzere iki tip inhibitör ile çözelti değişiminden sonra gözlendi. Bu prosedürün kritik adımları, mikroakışkan kanallarda tek bir kristalin oluşumu ve izolasyonu ve etrafındaki çözeltinin değişimidir. Bu yöntem, inhibitörlerin bu kristallerle etkileşime girdiği mekanizmayı anlamak için yüksek sıcaklığa duyarlı diğer kristal malzemelerle birlikte kullanılabilir.
Kristaller etrafında çözelti alışverişinde bulunma yeteneği, araştırmacıların antifriz proteinlerinin bağlanma mekanizmasına ilişkin temel bilgileri tanımlamalarının ve buz büyümesi üzerinde yeni bir izotop etkisi fenomeni keşfetmelerinin yolunu açtı.
