פרוטוקול זה הוא ייחודי משום שהוא מאפשר למשתמש ללמוד ולבחון ולמדוד את האינטראקציה בין מולקולות מסיסות למשטחי גבישים. ראיות חזקות לקשירה בלתי הפיכה של חלבונים נוגדי הקפאה לקרח או שהושגו בשיטה זו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לשלוט על הצמיחה של קרח בגודל מיקרון גבישים hydrate ולהחליף את הפתרון סביבם באופן מבוקר.
כדי להתחיל, מניחים את התבנית שהוכנה מראש בצלחת פטרי זכוכית מכוסה רדיד אלומיניום. לאחר מכן מכינים 30 עד 40 מיליליטר של תערובת PDMS על ידי שקילה של תערובת 1 עד 10 של חומר הריפוי והאלסטומר ומערבבים ברציפות במשך כחמש דקות עד שהתערובת נראית לבנה וכמעט אטומה. לאחר מכן, יוצקים את תערובת PDMS לתוך צלחת פטרי עם עובש דגה ב desiccator עד לא נשארות בועות.
אופים את התבנית עם ה-PDMS הנוזלי בתנור או על פלטה חמה ב-70 מעלות צלזיוס עד לקבלת מרקם דמוי גומי. לאחר מכן חתכו את המכשיר על ידי התחקות אחר התכונות עם אזמל, תוך הקפדה לדחוף קדימה עם האזמל במקום למטה, מכיוון שהתבנית שברירית. לאחר הסרת התקן PDMS חתוך, הנח אותו הפוך בצלחת פטרי חדשה.
באמצעות מזרק קהה, מחט 20 מד, לנקב חורים במכשיר על בסיס התבנית המוטבעת. לאחר מכן הכנס את ה- PDMS המנוקה והחליק את הכיסוי למנקה הפלזמה. סגור את השסתומים והפעל את הכוח, הוואקום והמשאבה.
תנו למנקה הפלזמה לפעול במשך כדקה. הגדר את ה- RF לגבוה ואפשר לחלק מהאוויר להיכנס למנקה הפלזמה באמצעות השסתום העדין. כאשר צבע חלונות הצפייה משתנה מסגול לוורוד, תן למנקה הפלזמה לעבוד במשך 50 שניות כדי לכבות את ה- RF.
שמור את המשאבה דולקת למשך דקה, ולאחר כיבויה, פתח בהדרגה את השסתום הראשי כדי לאפשר לאוויר להיכנס למנקה הפלזמה. לאחר מכן לחץ על משטח ה- PDMS על הכיסוי המנוקה וודא שהם מחוברים על ידי התבוננות ללא ניתוק בעת משיכה קלה כלפי מעלה על הכיסוי. לאחר אבטחת המחט של מחט קהה בזווית של 90 מעלות עם זוג צבתות, הכנס קצה אחד של המחט לתוך צינור טייגון ואת הקצה השני לתוך אחד החורים המנוקבים של המכשיר תוך חזרה על התהליך עבור החורים האחרים.
מרחו כמות קטנה של שמן טבילה על פני השטח של שלב הנחושת הקר ופזרו אותו באמצעות מגבון ללא מוך ליצירת שכבה דקה של שמן. לאחר מכן, מניחים דיסק ספיר נקי על שכבת השמן שנוצרה. לאחר מכן יש למרוח טיפה של שמן טבילה על מרכז דיסק הספיר ולמקם את התקן ה-PDMS על הטיפה, כך שתכונות המכשיר מיושרות מעל חור הצפייה של השלב הקר.
לאחר החזקת המכשיר במקומו, הצמידו את הצינורות לקירות החיצוניים של קופסת האלומיניום שבה נמצא סרט הדבקה. באמצעות מזרק זכוכית, להזריק ארבעה עד חמישה microliters של תמיסת חלבון נוגד הקפאה לתוך תעלת הכניסה ולסגור את המכסה של השלב הקר. התחל את תוכנית בקרת הטמפרטורה והגדר את הטמפרטורה למינוס 25 מעלות צלזיוס.
ואז לאט לאט להגדיל את הטמפרטורה על ידי כמעלה אחת צלזיוס לכל חמש שניות. התקרבו לנקודת ההתכה של הדגימות, שיכולות לנוע בין מינוס 1 למינוס 0.2 מעלות צלזיוס, בהתאם למאגר המשמש בתמיסת החלבון נוגדת ההקפאה. כדי לצפות טוב יותר בגבישים בודדים, עבור ליעדים של פי 10 או 20x.
ולאחר קבלת גביש יחיד במיקום הרצוי, לגדל את הגביש על ידי ירידה קלה בטמפרטורה עד שקצות הגביש פוגשים את קירות התעלה. לאחר המעבר ליעד 50x, הזריקו את תמיסת החלבון נוגדת ההקפאה לתעלות וצפו בעליית עוצמת הפלואורסצנטיות, מה שמעיד על כך שתמיסת החלבון הוזרקה בהצלחה לתעלות. כדי לתעד את תהליך החלפת התמיסה, השתמש בתוכנית ההדמיה NIS-Elements, כדי לוודא שהלחץ המופעל אינו גבוה מדי ולהזריק באיטיות את תמיסת המאגר לכניסה השנייה של ההתקן המיקרופלואידי.
שימו לב לירידה באות הפלואורסצנטי בקצב התלוי בלחץ המופעל על המזרק. כדי לקבל הידרטים THF לאחר הכנת תמיסת מים THF עם יחס טוחן של 1 עד 15, להזריק את התמיסה לתוך המכשיר microfluidic. לאחר שתמיסת המים THF קפואה, העלו באיטיות את הטמפרטורה עד שכל הקרח נמס בהרחקת ההידרטים והחזיקו את הטמפרטורה על מעלה אחת צלזיוס למשך שלוש דקות.
הגדר את הטמפרטורה למינוס שתי מעלות צלזיוס והתבונן בשפע ההידרטים המופיעים בתעלות המיקרופלואידיות בהיעדר מעכבים. לאחר מכן להזריק את החלבון או המעכב נוגד ההקפאה לתעלה המיקרופלואידית באמצעות מזרק הזכוכית תוך התאמת הטמפרטורה כדי להבטיח שהגבישים המתקבלים לא נמסים או גדלים ומאפשרים למספר דקות למולקולות המעכבות להיספג למשטח הגביש. בצע את חילופי התמיסה על ידי הזרקת התמיסה ללא מעכבים לערוץ.
צלם תמונות של הגביש לפני ואחרי חילופי התמיסה ונתח את עוצמת הפלואורסצנטיות בגביש ובתמיסה באמצעות תוכנית ההדמיה. בוצע חילופי תמיסה מוצלחים סביב גביש קרח המעידים על כך שחילופי התמיסה היו מהירים יחסית. עם זאת, החלפה איטית יותר אפשרית.
עוצמת הפלואורסצנטיות שהגיעה ממולקולות הגליקופרוטאינים נוגדי הקפאה של ספיחת הקרח נצפתה בבירור לאחר השלמת ההחלפה. ניתוח כמותי של ריכוז החלבונים נוגדי ההקפאה היה במעקב ועוצמת הפלואורסצנטיות נקבעה בתמיסה ועל הקרח, מה שמצביע על כך שהאות הפלואורסצנטי בתמיסה יורד בפקטור של 100 במהלך חילופי התמיסה, בעוד האות המחושב על פני הקרח נשאר קבוע. ניסויים מיקרופלואידיים עם הידרטים של THF בוצעו כאשר תמיסה ללא מעכבים הוזרקה לתעלות לאחר שגבישי ההידרט הורשו לספוח את מולקולות המעכב.
הידרטים של THF נצפו לאחר חילופי תמיסה עם שני סוגים של מעכבים, כולל גליקופרוטאינים נוגדי הקפאה המסומנים באיזותיוציאנט פלואורסצין וספרנין O, צבע פלואורסצנטי. השלבים הקריטיים של הליך זה הם היווצרות ובידוד של גביש יחיד בתעלות microfluidic ואת חילופי התמיסה סביבו. ניתן להשתמש בשיטה זו עם חומרים גבישיים אחרים הרגישים מאוד לטמפרטורה, במאמץ להבין את המנגנון שבאמצעותו מעכבים מתקשרים עם גבישים אלה.
היכולת להחליף תמיסות סביב גבישים סללה את הדרך לחוקרים לזהות תובנות מרכזיות על מנגנון הקשירה של חלבונים נוגדי הקפאה ולגלות תופעה חדשה של השפעת איזוטופים על צמיחת קרח.
