Este protocolo es único porque permite al usuario estudiar, examinar y medir la interacción entre moléculas solubles y superficies cristalinas. Pruebas sólidas de la unión irreversible de proteínas anticongelantes al hielo u obtenidas mediante este método. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de controlar el crecimiento de cristales de hielo e hidratar micras e intercambiar la solución a su alrededor de manera controlada.
Para comenzar, coloque el molde preparado previamente en una placa de Petri de vidrio cubierta con papel de aluminio. Luego prepare de 30 a 40 mililitros de la mezcla PDMS pesando una mezcla de 1 a 10 del agente de curado y el elastómero y mezclando continuamente durante aproximadamente cinco minutos hasta que la mezcla aparezca blanca y casi opaca. A continuación, vierta la mezcla de PDMS en la placa de Petri con el molde y desgasifique en un desecador hasta que no queden burbujas.
Hornea el molde con el líquido PDMS en un horno o en una placa caliente a 70 grados centígrados hasta obtener una consistencia similar al caucho. Luego corte el dispositivo trazando alrededor de las características con un bisturí, teniendo cuidado de empujar hacia adelante con el bisturí en lugar de hacia abajo, ya que el moho es frágil. Después de retirar el dispositivo PDMS recortado, colóquelo boca abajo en una nueva placa de Petri.
Con una jeringa roma, aguja de calibre 20, perfore agujeros en el dispositivo según el patrón impreso. A continuación, inserte el PDMS limpio y el cubreobjetos en el limpiador de plasma. Cierre las válvulas y encienda la alimentación, el vacío y la bomba.
Deje que el limpiador de plasma funcione durante aproximadamente un minuto. Ajuste la RF a alta y permita que entre algo de aire en el limpiador de plasma utilizando la válvula fina. Cuando el color de las ventanas de visualización cambie de púrpura a rosa, deje que el limpiador de plasma funcione durante 50 segundos para apagar el RF.
Mantenga la bomba encendida durante un minuto y, después de apagarla, abra gradualmente la válvula principal para permitir que el aire entre en el limpiador de plasma. A continuación, presione la superficie del PDMS sobre el cubreobjetos limpio y confirme que están unidos observando que no hay desprendimiento al tirar ligeramente hacia arriba del cubreobjetos. Después de asegurar la aguja de una aguja roma de 90 grados con un par de alicates, inserte un extremo de la aguja en un tubo Tygon y el otro extremo en uno de los orificios perforados del dispositivo mientras repite el proceso para los otros orificios.
Aplique una pequeña cantidad de aceite de inmersión en la superficie de la etapa fría de cobre y extiéndala con una toallita sin pelusa para crear una capa delgada de aceite. A continuación, coloque el disco de zafiro limpio en la capa de aceite creada. Luego aplique una gota de aceite de inmersión en el centro del disco de zafiro y coloque el dispositivo PDMS en la gota de modo que las características del dispositivo estén alineadas sobre el orificio de visualización de la etapa fría.
Después de mantener el dispositivo en su lugar, asegure el tubo a las paredes exteriores de la caja de aluminio que alberga la cinta adhesiva. Con una jeringa de vidrio, inyecte de cuatro a cinco microlitros de solución de proteína anticongelante en el canal de entrada y cierre la tapa de la etapa fría. Inicie el programa de control de temperatura y ajuste la temperatura a menos 25 grados centígrados.
Luego aumente lentamente la temperatura en aproximadamente un grado Celsius por cinco segundos. Acérquese al punto de fusión de las muestras, que puede variar de menos 1 a menos 0,2 grados centígrados, dependiendo del tampón utilizado en la solución de proteína anticongelante. Para observar mejor los cristales individuales, cambie a objetivos 10x o 20x.
Y después de obtener un solo cristal en la ubicación deseada, haga crecer el cristal disminuyendo ligeramente la temperatura hasta que los extremos del cristal se encuentren con las paredes del canal. Después de cambiar al objetivo 50x, inyecte la solución de proteína anticongelante en los canales y observe el aumento de la intensidad de fluorescencia, lo que indica que la solución de proteína se inyectó con éxito en los canales. Para registrar el proceso de intercambio de soluciones, utilice el programa de imágenes NIS-Elements, asegurándose de que la presión aplicada no sea demasiado alta e inyecte lentamente la solución tampón en la segunda entrada del dispositivo microfluídico.
Observe una disminución en la señal fluorescente a una velocidad que depende de la presión aplicada a la jeringa. Para obtener hidratos de THF después de preparar una solución de agua de THF con una relación molar de 1 a 15, inyecte la solución en el dispositivo microfluídico. Después de congelar la solución de agua THF, aumente lentamente la temperatura hasta que todo el hielo se haya derretido con exclusión de los hidratos y mantenga la temperatura a un grado centígrado durante tres minutos.
Ajuste la temperatura a menos dos grados centígrados y observe la abundancia de hidratos que aparecen en los canales microfluídicos en ausencia de inhibidores. Luego inyecte la proteína anticongelante o inhibidor en el canal microfluídico usando la jeringa de vidrio mientras ajusta la temperatura para asegurarse de que los cristales obtenidos no se derritan o crezcan y espere unos minutos para que las moléculas inhibidoras se adsorban a la superficie del cristal. Realice el intercambio de solución inyectando la solución libre de inhibidor en el canal.
Tome imágenes del cristal antes y después del intercambio de soluciones y analice la intensidad de fluorescencia en el cristal y en la solución utilizando el programa de imágenes. Se realizó un intercambio de solución exitoso alrededor de un cristal de hielo, lo que indica que el intercambio de solución fue relativamente rápido. Sin embargo, es posible un intercambio más lento.
La intensidad de fluorescencia proveniente de las moléculas de glicoproteínas anticongelantes adsorbidas por hielo se observó claramente después de que se completó el intercambio. Se monitorizó un análisis cuantitativo de la concentración de proteínas anticongelantes y se determinó la intensidad de fluorescencia en la solución y en el hielo, lo que indica que la señal de fluorescencia en la solución disminuye en un factor de 100 durante el intercambio de la solución, mientras que la señal calculada en la superficie del hielo permanece constante. Se llevaron a cabo experimentos microfluídicos con hidratos de THF donde se inyectó una solución libre de inhibidores en los canales después de que se permitió que los cristales de hidratos adsorbieran las moléculas inhibidoras.
Los hidratos de THF se observaron después del intercambio de solución con dos tipos de inhibidores, incluidas las glicoproteínas anticongelantes marcadas con isotiocianato de fluoresceína y Safranin O, un colorante fluorescente. Los pasos críticos de este procedimiento son la formación y el aislamiento de un solo cristal en los canales microfluídicos y el intercambio de solución a su alrededor. Este método se puede utilizar con otros materiales cristalinos que son altamente sensibles a la temperatura, en un esfuerzo por comprender el mecanismo por el cual los inhibidores interactúan con estos cristales.
La capacidad de intercambiar soluciones alrededor de cristales allanó el camino para que los investigadores identificaran información clave sobre el mecanismo de unión de las proteínas anticongelantes y descubrieran un nuevo fenómeno de efecto isotópico en el crecimiento del hielo.
