Questo protocollo è unico perché consente all'utente di studiare, esaminare e misurare l'interazione tra molecole solubili e superfici cristalline. Forte evidenza di legame irreversibile delle proteine antigelo al ghiaccio o ottenuto utilizzando questo metodo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di controllare la crescita di ghiaccio di dimensioni micron e cristalli di idrato e scambiare la soluzione intorno a loro in modo controllato.
Per iniziare, posizionare lo stampo pre-preparato in una piastra di Petri di vetro ricoperta di foglio di alluminio. Quindi preparare da 30 a 40 millilitri della miscela PDMS pesando da 1 a 10 miscele di agente polimerizzante ed elastomero e mescolando continuamente per circa cinque minuti fino a quando la miscela appare bianca e quasi opaca. Quindi, versare la miscela PDMS nella capsula di Petri con lo stampo e degassare in un essiccatore fino a quando non rimangono bolle.
Cuocere lo stampo con il PDMS liquido in forno o su una piastra calda a 70 gradi Celsius fino ad ottenere una consistenza simile alla gomma. Quindi ritagliare il dispositivo tracciando le caratteristiche con un bisturi, avendo cura di spingere in avanti con il bisturi anziché verso il basso, poiché lo stampo è fragile. Dopo aver rimosso il dispositivo PDMS ritagliato, posizionarlo capovolto in una nuova capsula di Petri.
Utilizzando una siringa smussata, ago calibro 20, perforare i fori nel dispositivo in base al modello stampato. Quindi inserire il PDMS pulito e il coprislip nel detergente al plasma. Chiudere le valvole e accendere l'alimentazione, il vuoto e la pompa.
Lasciare funzionare il detergente al plasma per circa un minuto. Impostare la RF su alta e consentire all'aria di entrare nel pulitore al plasma utilizzando la valvola fine. Quando il colore delle finestre di visualizzazione cambia da viola a rosa, lasciare agire il pulitore al plasma per 50 secondi per spegnere la RF.
Tenere la pompa accesa per un minuto e, dopo averla spenta, aprire gradualmente la valvola principale per consentire all'aria di entrare nel pulitore al plasma. Quindi premere la superficie PDMS sul vetrino pulito e verificare che siano incollati osservando che non si stacchi quando si tira leggermente verso l'alto sul vetrino. Dopo aver fissato l'ago di un ago smussato a 90 gradi con un paio di pinze, inserire un'estremità dell'ago in un tubo Tygon e l'altra estremità in uno dei fori perforati del dispositivo ripetendo il processo per gli altri fori.
Applicare una piccola quantità di olio ad immersione sulla superficie della fase fredda di rame e distribuirla usando una salvietta priva di lanugine per creare un sottile strato di olio. Quindi, posizionare il disco di zaffiro pulito sullo strato di olio creato. Quindi applicare una goccia di olio ad immersione sul centro del disco di zaffiro e posizionare il dispositivo PDMS sulla goccia in modo che le caratteristiche del dispositivo siano allineate sul foro di visualizzazione del palcoscenico freddo.
Dopo aver tenuto il dispositivo in posizione, fissare il tubo alle pareti esterne della scatola di alluminio che ospita il nastro adesivo. Utilizzando una siringa di vetro, iniettare da quattro a cinque microlitri di soluzione proteica antigelo nel canale di ingresso e chiudere il coperchio della fase fredda. Avviare il programma di controllo della temperatura e impostare la temperatura su meno 25 gradi Celsius.
Quindi aumentare lentamente la temperatura di circa un grado Celsius ogni cinque secondi. Avvicinarsi al punto di fusione dei campioni, che può variare da meno 1 a meno 0,2 gradi Celsius, a seconda del tampone utilizzato nella soluzione proteica antigelo. Per osservare meglio i singoli cristalli, passa a obiettivi 10x o 20x.
E dopo aver ottenuto un singolo cristallo nella posizione desiderata, far crescere il cristallo diminuendo leggermente la temperatura fino a quando le estremità del cristallo incontrano le pareti del canale. Dopo essere passati all'obiettivo 50x, iniettare la soluzione proteica antigelo nei canali e osservare l'aumento dell'intensità della fluorescenza, indicando che la soluzione proteica è stata iniettata con successo nei canali. Per registrare il processo di sostituzione della soluzione, utilizzare il programma NIS-Elements Imaging, assicurandosi che la pressione applicata non sia troppo elevata e iniettare lentamente la soluzione tampone nel secondo ingresso del dispositivo microfluidico.
Osservare una diminuzione del segnale fluorescente ad una velocità che dipende dalla pressione applicata alla siringa. Per ottenere idrati di THF dopo aver preparato una soluzione acquosa di THF con un rapporto molare da 1 a 15, iniettare la soluzione nel dispositivo microfluidico. Dopo che la soluzione acquosa di THF è stata congelata, aumentare lentamente la temperatura fino a quando tutto il ghiaccio si è sciolto escludendo gli idrati e mantenere la temperatura a un grado Celsius per tre minuti.
Impostare la temperatura a meno due gradi Celsius e osservare l'abbondanza di idrati che appaiono nei canali microfluidici in assenza di inibitori. Quindi iniettare la proteina antigelo o l'inibitore nel canale microfluidico usando la siringa di vetro mentre si regola la temperatura per garantire che i cristalli ottenuti non si sciolgano o crescano e lasciare alcuni minuti alle molecole inibitrici per adsorbire la superficie del cristallo. Eseguire lo scambio della soluzione iniettando la soluzione priva di inibitori nel canale.
Scattare immagini del cristallo prima e dopo lo scambio della soluzione e analizzare l'intensità della fluorescenza sul cristallo e nella soluzione utilizzando il programma di imaging. È stato eseguito uno scambio di soluzioni di successo attorno a un cristallo di ghiaccio, indicando che lo scambio di soluzione era relativamente veloce. Tuttavia, è possibile uno scambio più lento.
L'intensità di fluorescenza proveniente dalle molecole di glicoproteine antigelo adsorbite dal ghiaccio è stata chiaramente osservata dopo che lo scambio è stato completato. È stata monitorata un'analisi quantitativa della concentrazione di proteine antigelo e l'intensità della fluorescenza è stata determinata nella soluzione e sul ghiaccio, indicando che il segnale di fluorescenza nella soluzione è diminuito di un fattore 100 durante lo scambio della soluzione, mentre il segnale calcolato sulla superficie del ghiaccio rimane costante. Sono stati condotti esperimenti microfluidici con idrati di THF in cui una soluzione priva di inibitori è stata iniettata nei canali dopo che i cristalli di idrato sono stati autorizzati ad assorbire le molecole inibitorie.
Gli idrati di THF sono stati osservati dopo lo scambio di soluzione con due tipi di inibitori, tra cui glicoproteine antigelo marcate con isotiocianato di fluoresceina e Safranin O, un colorante fluorescente. I passaggi critici di questa procedura sono la formazione e l'isolamento di un singolo cristallo nei canali microfluidici e lo scambio di soluzione attorno ad esso. Questo metodo può essere utilizzato con altri materiali cristallini altamente sensibili alla temperatura, nel tentativo di comprendere il meccanismo con cui gli inibitori interagiscono con questi cristalli.
La capacità di scambiare soluzioni intorno ai cristalli ha spianato la strada ai ricercatori per identificare informazioni chiave sul meccanismo di legame delle proteine antigelo e per scoprire un nuovo fenomeno di effetto isotopico sulla crescita del ghiaccio.
