يصف البروتوكول الحالي مقياسا للكشف عن نفاذية الخلايا في الجسم الحي لتقييم وظيفة الوصلات البطانية الضيقة في الغدد تحت الفك السفلي للفأر. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري للمسح بالليزر الفوتوني لا يتمتع فقط بميزة الفحص المجهري التقليدي متحد البؤر ولكن يمكن استخدامه أيضا للكشف عن الأنسجة العميقة والصورة بشكل أكثر وضوحا. توفر هذه التجربة طريقة جيدة لتقييم نفاذية الأوعية الدموية للأنسجة المختلفة وخاصة الأنسجة السطحية وأعضاء الحيوانات.
ابدأ باختيار أدوات التتبع المناسبة مثل الفلوريسئين ، الأيزوثيوسيانات ، المسمى ديكستران ورودامين ب ، المسمى ديكستران مع أطياف انبعاثات الإثارة المميزة ، لتقليل التداخل بين إشارات التألق لفحص النفاذية. قم بتخفيف الآثار إلى محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات إلى 100 ملليغرام لكل ملليلتر وتخزين القسمة المحمية من الضوء عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد تخدير ذكر الفأر البري البالغ من العمر 8 إلى 10 أسابيع ، أمسك رأس وعنق الفأر برفق لجعل جانب واحد من مقلة العين يبرز قليلا.
أدخل حقنة الأنسولين التي تحتوي على 100 ميكرولتر من خليط محلول التتبع الفلوري على طول زاوية العين بزاوية قائمة على العين. بعد الحقن ، ضع الماوس بسرعة على الورق المقوى في وضع ضعيف مع تسجيل أطرافه ورأسه. بالنسبة للغدة تحت الفك السفلي أو عزل SMG ، تحت المجهر المجسم ، قم بقطع بشرة الرقبة بمقص الأنسجة العام لفضح جانبي SMGs.
بعد ذلك ، استخدم إبرة فصل الأنسجة الحادة لفصل الكبسولة برفق عن سطح الغدة دون إتلاف أنسجة الغدة والأوعية الدموية والبنية الغدية. قم بتوصيل الحامل المخصص بجهاز الضغط السلبي وتحقق مما إذا كان تأثير الضغط السلبي قد تحقق بشكل صحيح مسبقا. ضع الرشاش المكشوف برفق على الحامل المخصص وامتص الأنسجة عن طريق شفط الضغط السلبي ، بعيدا عن جسم الفأر قدر الإمكان ، لتقليل آثار الحركة الناتجة عن التنفس والظروف الأخرى.
ابدأ التصوير بعد وقت قصير من اختيار موقع الغدة. الحصول على صور متسلسلة على طول المحور Z صعدت اثنين ميكرون بعيدا عن سطح الغدة حتى 70 إلى 140 ميكرون في الأنسجة لتوليد بناء ثلاثي الأبعاد. بعد ذلك ، احصل على تصوير الفاصل الزمني للأوعية لقياس نفاذية الأوعية الدموية في SMG.
في مربع حوار Explorer ، انقر فوق إضافة مجلد جديد "وقم بتغيير اسم الملف. بعد ذلك ، ارجع إلى عمود الاستحواذ. في XY ، التنسيق هو 512 × 512 ، والسرعة 400 هرتز.
قم بتشغيل X ثنائي الاتجاه ، واضبط عامل التكبير / التصغير على 0.75 و 1.5 للتكبير. بعد ذلك ، حدد XYT ضمن وضع الاستحواذ "للحصول على تصوير الفاصل الزمني. اضبط المدة على 20 ثانية أو 30 دقيقة أو أكثر حسب الحاجة التجريبية.
بعد ضبط الشروط ، انقر فوق "مباشر" لمراقبة تصوير الأوعية الدموية لقناتين وقنوات متداخلة في إطار تشكيل الصورة واختيار مجالات الاهتمام. انقر فوق ابدأ "لبدء التصوير". مقايسة نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي ، وصور ثلاثية الأبعاد للأوعية الدموية في الفئران.
الغدد تحت الفك السفلي موضحة هنا. في المجموعة الضابطة ، كان كل من المتتبعين موجودين في الأوعية الدموية للرشاش. نظرا لوزنه الجزيئي الصغير ، تمكن FD4 من التسرب من الأوعية الدموية إلى الجوانب القاعدية للأسيني والقنوات ، وبالتالي تصوير شكل الأسيني والقنوات بوضوح.
تم توزيع RD70 في الأوعية الدموية كبيرة الحجم والأوعية الدقيقة. في مجموعة ربط القناة ، تم نقل كل من FD4 و RD70 إلى الجوانب القاعدية للأسيني ، مما يشير إلى أن ربط القناة يمكن أن يعطل وظيفة الحاجز البطاني ويزيد من نفاذية الجزيئات الكبيرة. علاوة على ذلك ، أكدت نتائج شدة التألق FD4 و RD70 شبه الكمية هذه الملاحظات.
أظهرت الصور ثلاثية الأبعاد مضان أكثر غموضا ل FD4 و RD70 حول الأوعية الدموية في مجموعة الربط مقارنة بالمجموعة الضابطة. يعد عزل SMG الدقيق والتنسيب المناسب والمجهر من المتطلبات الأساسية للكشف الناجح. باتباع الإجراءات ، يمكن حساب معدل تدفق الدم عن طريق الزواج من حركة خلايا الدم الحمراء ويمكن مطاردة تسلل خلايا الدم الموسومة بالتألق.
