Le présent protocole décrit une mesure de détection de perméabilité paracellulaire in vivo pour évaluer la fonction des jonctions endothéliales serrées dans les glandes sous-maxillaires de souris. Néanmoins, la microscopie à balayage laser à deux photons présente non seulement l’avantage de la microscopie confocale conventionnelle, mais peut également être utilisée pour détecter plus clairement les tissus et les images plus profonds. Cette expérience fournit une bonne mesure méthodologique pour évaluer la perméabilité vasculaire de différents tissus, en particulier les tissus de surface et les organes des animaux.
Commencez par choisir des traceurs appropriés tels que la fluorescéine, l’isothiocyanate, le dextrane marqué et la rhodamine B, le dextrane marqué avec des spectres d’émissions d’excitation distincts, afin de minimiser l’interférence entre les signaux de fluorescence pour le test de perméabilité. Diluer les traces dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile en 100 milligrammes par millilitre et stocker les aliquotes à l’abri de la lumière à moins 20 degrés Celsius. Après avoir anesthésié la souris mâle de type sauvage âgée de 8 à 10 semaines, tenez doucement la tête et le cou de la souris pour faire légèrement saillir un côté du globe oculaire.
Insérez une seringue à insuline contenant 100 microlitres de mélange de solution traceur fluorescente le long du coin de l’œil perpendiculaire à l’œil. Après l’injection, placez rapidement la souris sur le carton en décubitus dorsal, les membres et la tête scotchés. Pour l’isolement de la glande sous-maxillaire ou de l’ASM, au microscope stéréoscopique, coupez l’épiderme du cou avec des ciseaux de tissu généraux pour exposer les deux côtés des SMG.
Ensuite, utilisez une aiguille de séparation des tissus émoussés pour séparer doucement la capsule de la surface de la glande sans endommager le tissu glandulaire, les vaisseaux sanguins et la structure glandulaire. Connectez le support personnalisé au dispositif à pression négative et vérifiez si l’effet de pression négative est correctement obtenu à l’avance. Placez doucement le SMG exposé sur le support personnalisé et aspirez le tissu par aspiration à pression négative, aussi loin que possible du corps de la souris, afin de réduire les artefacts de mouvement causés par la respiration et d’autres conditions.
Commencez l’imagerie peu de temps après le choix du site de la glande. Acquérir des images séquentielles le long de l’axe Z à deux microns de la surface de la glande jusqu’à 70 à 140 microns dans le tissu pour générer une construction tridimensionnelle. Ensuite, acquérir une imagerie accélérée des vaisseaux pour mesurer la perméabilité vasculaire dans le SMG.
Dans la boîte de dialogue Explorer, cliquez sur Ajouter un nouveau dossier et modifiez le nom du fichier. Ensuite, revenez à la colonne d’acquisition. En XY, le format est de 512 par 512 et la vitesse est de 400 hertz.
Activez l’option Bidirectionnelle X », définissez le facteur de zoom sur 0,75 et 1,5 pour le zoom. Ensuite, sélectionnez XYT sous Mode d’acquisition » pour acquérir l’imagerie accélérée. Définissez la durée sur 20 secondes, 30 minutes ou plus selon le besoin expérimental.
Après avoir défini les conditions, cliquez sur En direct pour observer l’imagerie vasculaire de deux canaux et des canaux qui se chevauchent dans le cadre de formation de photos et choisissez les zones d’intérêt. Cliquez sur Démarrer pour commencer l’imagerie. Essai de perméabilité vasculaire in vivo et images tridimensionnelles des vaisseaux sanguins chez la souris.
Les glandes sous-maxillaires sont montrées ici. Dans le groupe témoin, les deux traceurs existaient dans les vaisseaux sanguins du SMG. En raison de son faible poids moléculaire, FD4 a pu s’échapper des vaisseaux sanguins vers les côtés basaux des acini et des canaux, représentant ainsi clairement la forme des acini et des canaux.
Le RD70 a été distribué dans des vaisseaux sanguins et des microvaisseaux de grande taille. Dans le groupe ligature des canaux, FD4 et RD70 ont été extravasés vers les côtés basaux des acini, ce qui indique que la ligature des canaux pourrait perturber la fonction de barrière endothéliale et augmenter la perméabilité aux grosses molécules. De plus, les résultats semi-quantitatifs de l’intensité de fluorescence FD4 et RD70 ont confirmé ces observations.
Les images tridimensionnelles ont montré une fluorescence beaucoup plus obscure de FD4 et RD70 autour des vaisseaux sanguins dans le groupe ligature par rapport au groupe témoin. Une isolation SMG soigneuse, un placement approprié et le microscope sont des conditions préalables essentielles pour une détection réussie. En suivant les procédures, le débit sanguin peut être calculé en mariant le mouvement des globules rouges et l’infiltration des cellules sanguines marquées par fluorescence peut être chassée.
