Das vorliegende Protokoll beschreibt ein in vivo parazelluläres Permeabilitätsnachweismaß zur Bewertung der Funktion enger endothelialer Verbindungen in submandibulären Drüsen der Maus. Die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie hat jedoch nicht nur den Vorteil der konventionellen konfokalen Mikroskopie, sondern kann auch verwendet werden, um tieferes Gewebe zu erkennen und klarer abzubilden. Dieses Experiment bietet ein gutes methodisches Maß zur Beurteilung der vaskulären Permeabilität verschiedener Gewebe, insbesondere der Oberflächengewebe und Organe von Tieren.
Beginnen Sie mit der Auswahl geeigneter Tracer wie Fluorescein, Isothiocyanat, markiertem Dextran und Rhodamin B, markiertem Dextran mit ausgeprägten Anregungsemissionsspektren, um die Interferenz zwischen Fluoreszenzsignalen für den Permeabilitätstest zu minimieren. Verdünnen Sie die Spuren zu steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung in 100 Milligramm pro Milliliter und lagern Sie die vor Licht geschützten Aliquots bei minus 20 Grad Celsius. Nach der Betäubung der 8 bis 10 Wochen alten männlichen Wildtyp-Maus halten Sie vorsichtig Kopf und Hals der Maus, damit eine Seite des Augapfels leicht hervorsteht.
Führen Sie eine Insulinspritze mit 100 Mikrolitern fluoreszierender Tracerlösungsmischung entlang des Augenwinkels im rechten Winkel zum Auge ein. Nach der Injektion legen Sie die Maus schnell in Rückenlage mit Klebeband und geklebtem Kopf auf den Karton. Für die submandibuläre Drüse oder SMG-Isolierung schneiden Sie unter einem stereoskopischen Mikroskop die Epidermis des Halses mit einer allgemeinen Gewebeschere ab, um beide Seiten der SMGs freizulegen.
Als nächstes verwenden Sie eine stumpfe Gewebetrennungsnadel, um die Kapsel sanft von der Drüsenoberfläche zu trennen, ohne das Drüsengewebe, die Blutgefäße und die Drüsenstruktur zu beschädigen. Schließen Sie die kundenspezifische Halterung an das Unterdruckgerät an und prüfen Sie im Vorfeld, ob die Unterdruckwirkung richtig erreicht wird. Legen Sie das freiliegende SMG vorsichtig auf den maßgeschneiderten Halter und saugen Sie das Gewebe durch Unterdruckabsaugen so weit wie möglich vom Mauskörper ab, um Bewegungsartefakte zu reduzieren, die durch Atmung und andere Bedingungen verursacht werden.
Beginnen Sie mit der Bildgebung, kurz nachdem die Stelle der Drüse ausgewählt wurde. Erfassen Sie sequentielle Bilder entlang der Z-Achse, die zwei Mikrometer von der Oberfläche der Drüse entfernt sind, bis zu 70 bis 140 Mikrometer in das Gewebe, um eine dreidimensionale Konstruktion zu erzeugen. Als nächstes erfassen Sie eine Zeitrafferaufnahme der Gefäße, um die vaskuläre Permeabilität im SMG zu messen.
Klicken Sie im Explorer-Dialog auf "Neuen Ordner hinzufügen" und ändern Sie den Dateinamen. Kehren Sie dann zur Spalte "Erfassung" zurück. In XY ist das Format 512 x 512 und die Geschwindigkeit beträgt 400 Hertz.
Schalten Sie Bidirektional X" ein, stellen Sie den Zoomfaktor auf 0,75 und 1,5 für den Zoom ein. Als nächstes wählen Sie XYT unter "Aufnahmemodus", um Zeitrafferaufnahmen aufzunehmen. Stellen Sie die Dauer je nach experimentellem Bedarf auf 20 Sekunden, 30 Minuten oder länger ein.
Nachdem Sie die Bedingungen eingestellt haben, klicken Sie auf "Live", um die vaskuläre Bildgebung von zwei Kanälen und überlappenden Kanälen im Fotoformungsrahmen zu beobachten und die Interessengebiete auszuwählen. Klicken Sie auf "Start", um die Bildgebung zu starten. In-vivo-Gefäßpermeabilitätstest und dreidimensionale Bilder von Blutgefäßen in Mäusen.
Submandibuläre Drüsen sind hier dargestellt. In der Kontrollgruppe befanden sich beide Tracer in den Blutgefäßen der SMG. Aufgrund seines geringen Molekulargewichts konnte FD4 aus den Blutgefäßen zu den basalen Seiten von Acini und Kanälen austreten und so die Form der Acini und Gänge klar darstellen.
Das RD70 wurde in großen Blutgefäßen und Mikrogefäßen verteilt. In der Duct-Ligationsgruppe wurden sowohl FD4 als auch RD70 auf die basalen Seiten von Acini extravasiert, was darauf hindeutet, dass die Duct-Ligatur die endotheliale Barrierefunktion stören und die Permeabilität für große Moleküle erhöhen könnte. Darüber hinaus bestätigten die semiquantitativen FD4- und RD70-Fluoreszenzintensitätsergebnisse diese Beobachtungen.
Die dreidimensionalen Bilder zeigten eine viel verdecktere Fluoreszenz von FD4 und RD70 um Blutgefäße in der Ligationsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine sorgfältige SMG-Isolierung und geeignete Platzierung sowie das Mikroskop sind wesentliche Voraussetzungen für eine erfolgreiche Detektion. Nach den Verfahren kann die Blutflussrate berechnet werden, indem die Bewegung der roten Blutkörperchen geheiratet und die Infiltration der fluoreszenzmarkierten Blutzellen verfolgt werden kann.
