يقيس بروتوكولنا ATP ، وهو جهاز إرسال مهم في المثانة البولية ، مما سيسمح لنا بمزيد من الاستجواب للآليات التي تتحكم في إطلاقه. تقيس تقنيتنا ATP مباشرة من تجويف المثانة ، مما يجعلها أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية من التقنيات التي تستخدم الخلايا المزروعة أو أنسجة المثانة. سيوضح الإجراء كيرا هيلي وستيفاني دوجيرتي ، فنيو الأبحاث في مختبري.
للبدء ، حث التخدير الأولي عن طريق وضع الحيوان في صندوق مغلق بالغاز مع 4٪ إلى 5٪ إيزوفلوران في الأكسجين. قم بإعطاء اليوريتان تحت الجلد بشكل ثنائي ، ثم ضع الحيوان في قفص للسماح لليوريتان بالتأثير لمدة ساعتين تقريبا. بعد انتظار سريان مفعول اليوريتان ، اختبر مستوى التخدير المناسب عن طريق الضغط على قدم الحيوان باستخدام الملقط.
لمنع تقلص المثانة استجابة للانتفاخ أثناء التجربة ، قم بحقن الحيوان بعامل مانع عقدي ، سداسي الميثونيوم. بعد ذلك ، ضع مرهم العيون على عيون الحيوان لمنع الجفاف أثناء التجربة. الآن حلق بطن الحيوان وإجراء بضع البطن خط الوسط لفضح المثانة البولية.
باستخدام اللهب ، أشعل أحد طرفي أنبوب PE50 الطبي بطول قصير ، ضع إبرة قياس 22 في الطرف الآخر من الأنبوب ، واملأها بمحلول كريبس. ضع حلقة صغيرة من خياطة الحرير 3-0 فوق قبة المثانة وقم بإجراء فغر المثانة الصغير لإدخال الطرف المتوهج للقسطرة. أثناء إمساك القسطرة بيد واحدة ، شد حلقة الخياطة لتثبيت القسطرة في مكانها باليد الأخرى.
الانتهاء من تأمين القسطرة عن طريق ربط عقدتين في خياطة. اسحب القسطرة للخلف حتى يتلامس الرأس المتوهج مع جدار المثانة. اختبر الإعداد بحثا عن التسريبات عن طريق غرس كمية صغيرة من محلول كريبس من خلال القسطرة.
اغمس نهاية القسطرة الوريدية في مواد التشحيم الجراحية. امسك صماخ مجرى البول الخارجي برفق باستخدام ملقط ، وأدخل طرف القسطرة في فتحة مجرى البول في اتجاه الذيل ، كما هو موضح في المخطوطة. قم بتدوير القسطرة 90 درجة وتقدم بلطف.
أدخل القسطرة حتى يصبح محور قفل luer بعيدا بمقدار خمسة ملليمترات عن فتحة مجرى البول الخارجية. قم بتأمين القسطرة ومنع التسرب حول القسطرة عن طريق لف خياطة حريرية قصيرة الطول 3-0 حول صماخ مجرى البول الخارجي وربطها بإحكام. ثبت القسطرة على الذيل بشريط لاصق لمنع سحبها عن طريق الخطأ.
بمجرد القسطرة ، قم بضخ محلول كريبس برفق في المثانة من خلال قسطرة المثانة فوق العانة ، وتأكد من أن السائل يتدفق من قسطرة مجرى البول وليس حوله. أغلق شق البطن فوق المثانة باستخدام خياطة حريرية 3-0. ضع وسادة سفلية ماصة على وسادة تدفئة للحفاظ على حرارة الجسم وامتصاص السوائل.
قم بتأمين الحيوان على اللوح المائل للمساعدة في تصريف السائل داخل المثانة من خلال قسطرة مجرى البول ، ثم قم بتشغيل وسادة التدفئة. قم بتوصيل القسطرة فوق العانة بقضيب توقف ثلاثي الاتجاهات يربط القسطرة بمضخة حقنة ومحول ضغط. قم بتوصيل محول الضغط بجهاز كمبيوتر من خلال مكبر للصوت ونظام الحصول على البيانات.
قم ببث محلول كريبس من خلال القسطرة فوق العانة بمعدل 0.1 ملليلتر في الدقيقة ، واترك السائل يستنزف من خلال قسطرة مجرى البول لمدة ساعة واحدة لغسل أي ATP متبقي يتم إطلاقه أثناء زرع القسطرة. بعد فترة الغسيل هذه ، قم بتغطية قسطرة مجرى البول باستخدام قابس قفل luer. قم بقياس الضغط في المثانة وابحث عن ارتفاع بطيء في الضغط داخل المثانة إلى ضغط 30 سم من الماء دون زيادة حادة في الضغط ، مما يشير إلى تقلص المثانة.
قم بإزالة القابس من قسطرة مجرى البول عندما يصل الضغط إلى 30 سم من الماء لمنع تلف المثانة. لبث المثانة وجمع eluent من قسطرة مجرى البول. اختبر 100 ميكرولتر من المحلول على الفور من أجل ATP أو تجميده لتحديد كمية الدفعة اللاحقة.
لاختبار تأثير انتفاخ المثانة على تركيزات ATP اللمعية ، قم بتغطية قسطرة مجرى البول بالسدادة ومراقبة ضغط المثانة حتى تصل إلى المستوى المطلوب ، ثم قم بفك قسطرة مجرى البول وجمع المحلول لقياس ATP أو تجميده ، كما هو موضح أعلاه. بعد كل انتفاخ ، اسمح للمثانة بالراحة والاغتسال لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل أخذ عينات إضافية. لاختبار تأثير الأدوية على إطلاق ATP ، قم بتبديل محلول كريبس الذي يغرس المثانة إلى كريبس الذي يحتوي على الدواء المفضل.
قم بتوزيع الدواء لمدة 10 إلى 15 دقيقة ليكون له تأثير ، ثم اجمع العينات من المثانة غير المنتفخة والمنتفخة ، كما هو موضح سابقا. ضع عينة 100 ميكرولتر من البيرفوسات مع 50 ميكرولتر من مزيج الفحص في مقياس الإنارة للقراءة. للتحويل من وحدات الضوء النسبية إلى تركيز ATP ، قم بعمل تخفيفات متسلسلة ل ATP في محلول كريبس تتراوح من ميكرومولار واحد إلى 10 بيكومولار في تخفيفات عشرة أضعاف لإنشاء منحنى قياسي ، واقرأها في مقياس الإنارة.
ارسم القراءات الناتجة على رسم بياني وقم بإجراء انحدار غير خطي لاستقراء التركيزات من العينات المأخوذة من الحيوان. يؤدي تسريب المحلول إلى المثانة أثناء توصيل قسطرة مجرى البول إلى ارتفاع الضغط داخل المثانة بشكل حاد مع تقلص المثانة. بعد إعطاء سداسي الميثونيوم ، لوحظ ارتفاع تدريجي أكثر في الضغط داخل المثانة ، مما سمح للضغط بالارتفاع إلى 30 سم من الماء دون انكماش.
يقلل FCF الأزرق اللامع بشكل كبير من ميل المنحنى القياسي ، وهو ما يكفي لتغيير القيم المحسوبة لتركيز ATP في العينة. يمكن أن يؤدي حساب تركيز ATP في عينة باستخدام معيار كريبس الذي يحتوي على FCF أزرق لامع إلى تقليل تقدير تركيز ATP بنسبة 50٪ يؤدي انتفاخ المثانة إلى زيادة تركيزات ATP اللمعية ، والتي يمكن أن تتضاءل في وجود NTPDase apvrase ، أو تزداد عند تثبيط NTPD ACEs الداخلية مع ARL67156. تم تحليل إطلاق ATP الناجم عن التمدد من الظهارة البولية.
يتم حظر إطلاق ATP المستحث بالانتفاخ بواسطة مضادات قناة البانكتين ، و FCF الأزرق اللامع ، والكربونوكسولون ، ولكن ليس باستخدام مضاد قناة connexon ، 18 حمض ألفا glycyrrhetinic. من الضروري تحويل جميع قراءات مقياس الإنارة إلى تركيزات ATP باستخدام المنحنى القياسي المناسب ، حيث أن تفاعل Lucifer Luciferase شديد التأثر بالتداخل بواسطة مجموعة متنوعة من العوامل المختلفة. يمكن استخدام تقنيتنا لدراسة الإطلاق الناتج عن الانتفاخ لأي جزيء في تجويف المثانة ، على افتراض وجود اختبار مناسب لهذا الجزيء.
