우리의 프로토콜은 방광의 중요한 전달 물질 인 ATP를 측정하여 방출을 제어하는 메커니즘을 추가로 조사 할 수 있습니다. 우리의 기술은 방광 내강에서 직접 ATP를 측정하므로 배양 된 세포 또는 방광 조직을 사용하는 기술보다 생리 학적으로 더 관련이 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 기술자 인 Keara Healy와 Stephanie Daugherty가 될 것입니다.
시작하려면 산소에서 4%에서 5%이소플루란으로 가스가 공급된 밀폐된 상자에 동물을 넣어 초기 마취를 유도하십시오. 우레탄을 양측으로 피하 투여 한 다음 동물을 케이지에 넣어 우레탄이 거의 2 시간 동안 효과를 발휘할 수 있도록합니다. 우레탄이 효과를 발휘할 때까지 기다린 후 집게를 사용하여 동물의 발을 꼬집어 적절한 마취면을 테스트하십시오.
실험 중 팽창에 대한 반응으로 방광의 수축을 방지하려면 동물에게 신경절 차단제 인 헥사 메토 늄을 주사하십시오. 다음으로, 실험 중 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 용 연고를 바르십시오. 이제 동물의 복부를 면도하고 정중선 개복술을 시행하여 방광을 노출시킵니다.
화염을 사용하여 짧은 길이의 PE50 의료 튜브의 한쪽 끝을 플레어하고 22게이지 바늘을 튜브의 다른 쪽 끝에 놓고 Krebs 용액으로 채 웁니다. 방광의 돔 위에 3-0 실크 봉합사의 작은 고리를 놓고 작은 방광 절제술을 수행하여 카테터의 플레어 끝을 삽입합니다. 한 손으로 카테터를 잡고 다른 손으로 카테터를 제자리에 고정하기 위해 봉합사 루프를 조입니다.
봉합사에 두 개의 매듭을 묶어 카테터 고정을 마칩니다. 플레어 헤드가 방광 벽에 닿을 때까지 카테터를 뒤로 당깁니다. 카테터를 통해 소량의 Krebs 용액을 주입하여 누출 설정을 테스트합니다.
IV 카테터의 끝을 수술용 윤활유에 담그십시오. 한 쌍의 집게로 외부 요도 미투스를 부드럽게 잡고 원고에 설명 된대로 카테터 끝을 꼬리 방향으로 요도 구멍에 삽입하십시오. 카테터를 90도 회전하고 부드럽게 전진합니다.
루어 잠금 허브가 외부 요도 개구부에서 5mm 떨어져 있을 때까지 카테터를 삽입합니다. 카테터를 고정하고 외부 요도 미투스 주위에 짧은 길이의 3-0 실크 봉합사를 고리로 묶어 카테터 주변의 누출을 방지합니다. 카테터가 실수로 빠지지 않도록 테이프로 꼬리에 고정하십시오.
카테터 삽입이 완료되면 치골 상 방광 카테터를 통해 Krebs 용액을 방광에 부드럽게 주입하고 유체가 요도 카테터 주변이 아닌 요도 카테터에서 흘러 나오는지 확인합니다. 3-0 실크 봉합사를 사용하여 방광 위의 복부 절개를 닫습니다. 체온을 유지하고 체액을 흡수하기 위해 가열 패드에 흡수성 언더패드를 놓습니다.
요도 카테터를 통해 방광 내 액체를 배출하는 데 도움이 되도록 경사판에 동물을 고정한 다음 가열 패드를 켭니다. 치골 상부 카테터를 카테터를 주사기 펌프 및 압력 변환기에 연결하는 3방향 스톱 콕에 연결합니다. 압력 변환기를 증폭기와 데이터 수집 시스템을 통해 컴퓨터에 연결합니다.
분당 0.1 밀리리터의 속도로 치골 상 카테터를 통해 Krebs 용액을 주입하고 유체가 요도 카테터를 통해 1 시간 동안 배출되도록하여 카테터 이식 중에 방출 된 잔류 ATP를 씻어냅니다. 이 세척 기간이 지나면 루어 잠금 플러그를 사용하여 요도 카테터를 덮으십시오. 방광의 압력을 측정하고 방광 수축을 나타내는 급격한 압력 증가없이 방광 내 압력이 30cm 물의 압력으로 천천히 상승하는지 확인하십시오.
방광 손상을 방지하기 위해 압력이 30cm 물에 도달하면 요도 카테터에서 플러그를 제거하십시오. 방광을 주입하고 요도 카테터에서 용리액을 수집합니다. ATP에 대해 용리액의 100마이크로리터 분취량을 즉시 테스트하거나 나중에 배치 정량화를 위해 동결합니다.
방광 팽창이 내강 ATP 농도에 미치는 영향을 테스트하려면 플러그로 요도 카테터를 덮고 원하는 수준에 도달할 때까지 방광 압력을 모니터링한 다음 요도 카테터의 뚜껑을 열고 위에서 설명한 대로 ATP 측정 또는 동결을 위한 용리액을 수집합니다. 각 팽창 후 방광을 쉬게하고 추가 샘플을 채취하기 전에 10-15 분 동안 씻어냅니다. ATP 방출에 대한 약물의 효과를 테스트하려면 방광을 주입하는 Krebs 용액을 선택한 약물이 들어있는 Krebs로 전환하십시오.
효과를 내기 위해 약물을 10-15 분 동안 관류 한 다음 앞에서 설명한 것처럼 팽창되지 않고 팽창 된 방광에서 샘플을 수집하십시오. 100 마이크로리터의 향수물 샘플과 50 마이크로리터의 분석 혼합물을 판독을 위해 루미노미터에 놓습니다. 상대 광 단위에서 ATP 농도로 변환하려면 10 배 희석으로 1 마이크로 몰에서 10 피코 몰 범위의 Krebs 용액에서 ATP의 연속 희석을 만들어 표준 곡선을 만들고 광도계에서 읽습니다.
결과 판독값을 그래프에 플로팅하고 비선형 회귀를 수행하여 동물에서 채취한 샘플의 농도를 외삽합니다. 요도 카테터가 막혀있는 동안 방광에 용액을 주입하면 방광이 수축함에 따라 방광 내 압력이 급격히 상승합니다. 헥사 메 토늄 투여 후, 방광 내 압력의보다 점진적인 상승이 관찰되어 수축없이 압력이 30 센티미터까지 상승 할 수있었습니다.
브릴리언트 블루 FCF는 표준 곡선의 기울기를 크게 감소시켜 샘플의 ATP 농도에 대해 계산 된 값을 변경하기에 충분합니다. 화려한 청색 FCF를 포함하는 Krebs 표준을 사용하여 샘플에서 ATP 농도를 계산하면 ATP 농도가 50 % 과소 평가 될 수 있습니다 방광의 팽창은 NTPDase apvrase의 존재 하에서 감소 될 수있는 내강 ATP 농도를 증가 시키거나 내인성 NTPD ACE가 ARL67156으로 억제 될 때 증가 할 수 있습니다. 요로상피로부터 스트레치-유도된 ATP 방출을 분석하였다.
팽창 유발 ATP 방출은 파넥틴 채널 길항제, 브릴리언트 블루 FCF 및 카르보녹솔론에 의해 차단되지만 코넥슨 채널 길항제인 18알파-글리시레틴산으로는 차단되지 않습니다. 루시퍼 루시페라아제 반응은 다양한 약제의 간섭에 매우 취약하기 때문에 모든 광도계 판독값을 적절한 표준 곡선을 사용하여 ATP 농도로 변환하는 것이 필수적입니다. 우리의 기술은 방광 내강에있는 모든 분자의 팽창 유발 방출을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 해당 분자에 대한 적절한 분석이 존재한다고 가정합니다.
