Наш протокол измеряет АТФ, важный передатчик в мочевом пузыре, который позволит нам дополнительно исследовать механизмы, контролирующие его высвобождение. Наша методика измеряет АТФ непосредственно из просвета мочевого пузыря, что делает его более физиологически значимым, чем методы, использующие культивируемые клетки или ткань мочевого пузыря. Продемонстрировать процедуру будут Кеара Хили и Стефани Догерти, техники-исследователи в моей лаборатории.
Для начала индуцируйте начальную анестезию, помещая животное в закрытую коробку, отравленную газом от 4% до 5% изофлурана в кислороде. Подкожно вводят уретан двусторонне, затем поместите животное в клетку, чтобы уретан вступил в силу в течение почти двух часов. Дождавшись, пока уретан вступит в силу, проверьте правильную плоскость анестезии, зажав ногу животного с помощью щипцов.
Чтобы предотвратить сокращение мочевого пузыря в ответ на растяжение во время эксперимента, вводите животному ганглионно-блокирующее средство, гексаметоний. Далее нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить пересыхание во время эксперимента. Теперь побрить живот животного и выполнить лапаротомию средней линии, чтобы обнажить мочевой пузырь.
Используя пламя, вспыхните один конец короткой длины интрамедицинской трубки PE50, поместите иглу 22-го калибра в другой конец трубки и заполните ее раствором Кребса. Наложите небольшую петлю из 3-0 шелкового шва на купол мочевого пузыря и выполните небольшую цистостомию, чтобы вставить расклешенный конец катетера. Удерживая катетер одной рукой, затяните шовную петлю, чтобы закрепить катетер на месте другой рукой.
Закончите закрепление катетера, завязав два узла в шве. Оттяните катетер назад, пока расклешенная головка не соприкоснется со стенкой мочевого пузыря. Проверьте установку на наличие утечек, вливая небольшое количество раствора Кребса через катетер.
Окуните конец внутривенного катетера в хирургическую смазку. Осторожно удерживайте наружный уретральный меатус парой щипцов и вставьте кончик катетера в уретральное отверстие в направлении хвоста, как описано в рукописи. Поверните катетер на 90 градусов и осторожно вперед.
Вставьте катетер до тех пор, пока ступица замка люера не окажется в пяти миллиметрах дистально от наружного отверстия уретры. Закрепите катетер и предотвратите утечку вокруг катетера, закольцовав короткий шелковый шов длиной 3-0 вокруг наружного уретрального мяса и плотно завязав его. Закрепите катетер на хвосте с помощью ленты, чтобы предотвратить его случайное вытаскивание.
После катетеризации осторожно вводят раствор Кребса в мочевой пузырь через надлобковый катетер мочевого пузыря и подтверждают, что жидкость течет из уретрального катетера, а не вокруг него. Закройте брюшной разрез над мочевым пузырем с помощью шелкового шва 3-0. Поместите абсорбирующую подкладку на грелку, чтобы поддерживать тепло тела и поглощать жидкость.
Закрепите животное на наклонной доске, чтобы помочь в сливе внутрипузырной жидкости через уретральный катетер, затем включите грелку. Подключите надлобковый катетер к трехходовому стопорному крану, соединяющему катетер со шприцевым насосом и преобразователем давления. Подключите датчик давления к компьютеру через усилитель и систему сбора данных.
Вводят раствор Кребса через надлобковый катетер со скоростью 0,1 миллилитра в минуту и дают жидкости стекать через уретральный катетер в течение одного часа, чтобы вымыть любую остаточную АТФ, высвобождаемую во время имплантации катетера. После этого периода смывания закройте уретральный катетер с помощью заглушки блокировки luer. Измерьте давление в мочевом пузыре и ищите медленное повышение внутрипузырного давления до давления 30 сантиметров воды без резкого повышения давления, свидетельствующего о сокращении мочевого пузыря.
Снимите пробку из уретрального катетера, когда давление достигнет 30 сантиметров воды, чтобы предотвратить повреждение мочевого пузыря. Настойте мочевой пузырь и соберите элюент из уретрального катетера. Испытайте 100 микролитровых аликвот элюента немедленно на АТФ или заморозьте для последующей количественной оценки партии.
Чтобы проверить влияние растяжения мочевого пузыря на просветные концентрации АТФ, закройте уретральный катетер пробкой и контролируйте давление в мочевом пузыре, пока оно не достигнет желаемого уровня, затем отключите уретральный катетер и соберите элюент для измерения АТФ или замораживания, как описано выше. После каждого растяжения дайте мочевому пузырю отдохнуть и промыть его в течение 10-15 минут, прежде чем брать дополнительные пробы. Чтобы проверить влияние препаратов на высвобождение АТФ, переключите раствор Кребса, настояющий мочевой пузырь, на Кребс, содержащий препарат выбора.
Перфьюируйте препарат в течение 10-15 минут, чтобы иметь эффект, а затем соберите образцы из нерастянутых и растянутых мочевых пузырей, как было продемонстрировано ранее. Поместите 100 микролитров образца перфусата с 50 микролитрами пробирной смеси в люминометр для считывания. Для преобразования из относительных световых единиц в концентрацию АТФ производят серийные разбавления АТФ в растворе Кребса в диапазоне от одного микромоляра до 10 пикомоларов в десятикратных разведениях для создания стандартной кривой и считывают их в люминометре.
Нанесите полученные показания на график и выполните нелинейную регрессию для экстраполяции концентраций из образцов, взятых у животного. Инфузия раствора в мочевой пузырь, когда уретральный катетер закупорлен, вызывает резкое повышение внутрипузырного давления по мере сокращения мочевого пузыря. После введения гексаметония наблюдалось более постепенное повышение внутрипузырного давления, что позволяло давлению подниматься до 30 сантиметров воды без сокращения.
Блестящий синий FCF значительно уменьшает наклон стандартной кривой, достаточный для изменения расчетных значений концентрации АТФ в образце. Расчет концентрации АТФ в образце с использованием стандарта Кребса, содержащего блестящий синий FCF, может привести к недооценке концентрации АТФ на 50% Растяжение мочевого пузыря увеличивает люминальные концентрации АТФ, которые могут быть уменьшены в присутствии апвразы NTPDase или увеличены, когда эндогенные NTPD ACEs ингибируются ARL67156. Анализировали индуцированное растяжением высвобождение АТФ из уротелия.
Высвобождение АТФ, вызванное растяжением, блокируется антагонистами панектиновых каналов, блестящим синим FCF и карбоноксолоном, но не антагонистом канала коннексона, 18 альфа-глицирретиновой кислотой. Крайне важно, чтобы все показания люминометра преобразовывались в концентрации АТФ с использованием соответствующей стандартной кривой, поскольку реакция Люцифера Люциферазы очень восприимчива к интерференции со стороны широкого спектра различных агентов. Наш метод может быть использован для изучения вызванного растяжением высвобождения любой молекулы в просвете мочевого пузыря, предполагая, что для этой молекулы существует подходящий анализ.
